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香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp. cubense,Foc)引起的一种典型土传真菌性病害,随着病害的不断蔓延,造成病害面积不断扩大,已经严重威胁到我国香蕉种植的正常生产。香蕉枯萎病菌腐生能力极强,在土壤中可以长期生存,目前仍没有找到非常有效的防治方法,利用生物防治、土壤处理以及轮作等措施,效果均不理想,培育抗枯品种是解决香蕉枯萎病的根本途径之一。真菌小RNA (MicroRNA-lIke RNAs,milRNAs)是真菌中存在的一类非编码小分子RNA,不仅能够诱导基因沉默,还能通过RNAi路径抑制寄主植物的免疫系统,在真菌致病机理及植物免疫过程中发挥着重要的调控作用。本研究结合长期对香蕉枯萎病菌的研究,利用Solexa测序技术,对Focl孢子、Foc1菌丝、Foc4孢子和Foc4菌丝四个样品进行测序和分析,挖掘候选小RNAs,采用烟草瞬时表达方法提高香蕉枯萎病菌中低丰度表达milRNAs的表达量,并且通过Northern杂交技术对候选milRNAs进行实验验证,将为深入研究Foc侵染相关milRNAs在Foc侵染过程中的生物学功能奠定坚实的基础,对后续开展以milRNAs作为RNAi基因沉默靶标的转基因抗枯品系培育具有重要意义。主要研究结果如下:1.利用Solexa高通量测序技术,对香蕉枯萎病菌Foc1孢子、Foc1菌丝、Foc4孢子和Foc4菌丝4个样品进行深度测序,共挖掘到小分子RNA序列数为93204898条,4个样品中小分子RNAs的序列数量及碱基数量分布的差异不显著;不同样品在测序整体上的一致性较好,表明测序数据具有较高可靠性,可用于后续实验分析;4个样品的小RNAs数量和种类数量分别在所有小分子RNAs总数和种类数中所占比例均为最低,测序预测到的候选milRNA序列长度分布以19-25 nt为主要类型;4个样品中长度在19-22 nt之间的milRNAs,其首位点碱基均对U的偏好性最高,小RNAs在2-4号位的碱基分布中U含量极少,第10位碱基对A的偏好性极高。2.通过与数据库的比对,共预测到354个候选小RNAs,其中221个为已知的候选小RNAs,包括133个植物中已知的小RNAs和88个真菌中已知的小RNAs, 133个为新的候选小RNAs;各种小RNAs在4个样品中存在差异,表明小RNA可能参与香蕉枯萎病菌不同生理小种及各生长阶段的调控。利用miRNA靶基因预测软件TargetFinder,354个候选小RNAs共预测得到2186个靶基因。4个样品小RNA的靶基因GO功能分类中,以规类到生物过程的靶基因数量最多。共有1261个靶基因被注释到214个KEGG代谢路径中,其中1193个靶基因被注释到新陈代谢路径中,在代谢过程中通过调控氨基酸、各种酶以及次级代谢产物等路径,从而实现对真菌整体的生长调控。3.采用Northern杂交技术,验证了香蕉枯萎病菌中确实存在着20个小RNA,其中2个为高丰度表达小RNA,可以直接采用Northern杂交进行验证,其余18个小RNA为低丰度表达小RNA,不能直接采用Northern杂交进行验证,但可以利用烟草瞬时表达技术,提高其在烟草中的表达量,然后可采用Northern杂交进行验证。鉴定出的20个小RNA中,16个为已知的小RNA,其余4个为新发现小 RNA,分别为 novel-milR16、novel-milR31、novel-milR19、novel-milR168。后续工作将对剩余的300多个候选小RNA进行鉴定,以及对这20个小RNA开展功能分析。