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目的:乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤,尽管早期乳腺癌术后接受规范化治疗,仍有部分患者会发生复发转移,探索乳腺癌治疗的新靶点进行个体化治疗至关重要。PARP抑制剂靶向聚ADP核糖聚合酶（Poly ADP-ribose Polymerase,PARP）,是第一种成功利用合成致死（Synthetic Lethality）概念获得批准在临床使用的抗肿瘤药物。目前奥拉帕尼和他拉唑帕尼被批准用于BRCA突变、HER2阴性转移性的乳腺癌。BRCA突变是预测PARP抑制剂敏感性的最主要的生物标志物,然而,BRCA突变的乳腺癌占所有乳腺癌的5.3%和三阴性乳腺癌的11.2%,限制了PARP抑制剂在临床的应用。除BRCA突变,PARP抑制剂与DNA损伤修复通路中的其他一些基因也存在合成致死作用。对于BRCA野生型乳腺癌,PARP抑制剂联合靶向其他DNA修复的基因的药物可能增加PARP抑制剂的疗效。本研究第一部分筛选出FEN1低表达是BRCA野生型乳腺癌PARP抑制剂治疗敏感的标志物,而FEN1高表达降低PARP抑制剂敏感性,以BRCA野生型三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468为模型,深入研究FEN1参与调控PARP抑制剂敏感性的机制。第二部分发现p53突变乳腺癌细胞系对PARP抑制剂不敏感,以p53突变型乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468和p53野生型乳腺癌细胞系MCF-7为模型,深入研究p53突变参与调控PARP抑制剂敏感性的机制。研究方法:1、下载TCGA及GEO乳腺癌数据集分析基因功能;2、构建靶向沉默FEN1基因的慢病毒表达载体,建立稳定转染的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468;3、采用脂质体介导的si RNA转染下调FEN1、PD-L1、p53、FOXM1等目标蛋白的表达;4、采用脂质体介导的c DNA质粒转染过表达p53（R273H）突变蛋白;5、采用MTT法检测细胞活力;6、采用Annexin V-FITC流式细胞术检测细胞凋亡;7、采用碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）单染流式细胞术检测细胞周期;8、采用质谱分析筛选与FEN1、PD-L1结合的蛋白;9、采用免疫共沉淀法验证质谱分析法筛选出的与FEN1、PD-L1结合的蛋白;10、采用蛋白免疫印迹技术（Western blotting）检测FEN1、ATR、Top BP1、Chk1、磷酸化Chk1、RAD51、PD-L1、TOP2A、p53、磷酸化p53、FOXM1、BRCA2等目标蛋白的表达;11、采用RT-q PCR实验方法检测ATR、Top BP1、Chk1、PD-L1、RAD51、BRCA2等目的基因的m RNA水平表达;12、统计学分析:实验结果以平均值±标准差表示,图形用Graph Pad 7.0进行绘制,t检验评估统计学意义。P值<0.05被认为具有统计学差异。结果:1、FEN1高表达三阴性乳腺癌细胞对PARP抑制剂敏感性差。利用TCGA乳腺癌数据集计算HRD评分,筛选与PARP抑制剂有合成致死作用的基因,提示FEN1与HRD评分负相关,FEN1低表达对PARP抑制剂敏感。MTT实验显示,FEN1低表达的MDA-MB-231细胞对奥拉帕尼敏感,而FEN1高表达的MDA-MB-468细胞对奥拉帕尼的敏感性差。2、抑制FEN1增加乳腺癌细胞对PARP抑制剂的敏感性。应用对照和沉默FEN1的慢病毒转染MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞下调FEN1蛋白表达,MTT实验结果奥拉帕尼敏感性增强。与奥拉帕尼单药相比,奥拉帕尼联合FEN1抑制剂C20可进一步抑制细胞活性,Calcu Syn软件分析了细胞生长曲线提示两种药物联合应用具有协同抗增殖作用。3、抑制FEN1增加PARP抑制剂诱导的凋亡。应用FEN1 si RNA转染细胞下调FEN1蛋白表达,流式细胞术结果显示奥拉帕尼作用于FEN1 si RNA干扰的MDA-MB-468细胞,可使细胞凋亡增加。奥拉帕尼联合FEN1抑制剂C20作用于MDA-MB-468细胞,与单药奥拉帕尼相比,同样可使细胞凋亡增加。4、抑制FEN1减少PARP抑制剂引起的G2/M期阻滞。流式细胞术结果显示奥拉帕尼作用于MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞后引起G2/M期阻滞,si RNA下调FEN1蛋白表达和应用FEN1抑制剂C20减少奥拉帕尼引起的G2/M期阻滞。5、抑制FEN1减少PARP抑制剂引起的ATR/Chk1活化。下载GEO数据库198例三阴性乳腺癌m RNA表达谱数据,IPA通路分析提示FEN1参与G2/M期DNA损伤检查点调控。蛋白免疫印迹法显示在MDA-MB-231和MDA-MB-468两种细胞系中,奥拉帕尼活化ATR/Chk1通路,促进参与同源重组的RAD51表达,慢病毒沉默FEN1蛋白表达或应用FEN1抑制剂C20抑制奥拉帕尼诱导的Chk1活化。结果表明,抑制FEN1通过抑制ATR/Chk1活化进而抑制同源重组修复,增加奥拉帕尼敏感性。6、FEN1与ATG5形成复合物促进自噬参与Chk1活化。质谱分析提示FEN1与ATG5有结合,免疫共沉淀验证在MDA-MB-231和MDA-MB-468两种细胞系中,FEN1与ATG5可以形成复合物。蛋白免疫印迹实验结果显示,慢病毒沉默FEN1或FEN1抑制剂C20作用后,LC3 II表达减少,证明抑制FEN1抑制自噬发生,最终抑制ATR/Chk1通路活化。7、抑制FEN1下调PD-L1的m RNA及蛋白水平。利用蛋白免疫印迹方法检测两种细胞系中PD-L1蛋白的表达,结果显示PD-L1蛋白在MDA-MB-231细胞中高表达,而在MDA-MB-468细胞中不表达。在MDA-MB-231细胞中应用si RNA下调FEN1蛋白表达或应用FEN1抑制剂C20,RT-q PCR和蛋白免疫印迹实验结果显示,si RNA下调FEN1蛋白表达或应用C20后,MDA-MB-231细胞的PD-L1 m RNA和蛋白水平显著下调。8、下调PD-L1蛋白表达增加PARP抑制剂诱导的凋亡。免疫印迹法显示奥拉帕尼作用于MDA-MB-231细胞后PD-L1表达逐渐增加。应用si RNA下调PD-L1的蛋白表达,流式细胞术显示奥拉帕尼作用于PD-L1 si RNA干扰的MDA-MB-231细胞,可使细胞凋亡增加。质谱分析筛选出PD-L1与TOP2A有结合,免疫共沉淀证实PD-L1与TOP2A可以形成复合物,并且在奥拉帕尼作用下,复合物结合增多。蛋白免疫印迹实验结果显示,si RNA下调PD-L1蛋白表达后,MDA-MB-231细胞的TOP2A蛋白水平也呈现显著下调趋势,加入蛋白酶抑制剂MG132后,逆转了TOP2A的蛋白的下调,提示PD-L1与TOP2A形成复合物稳定TOP2A蛋白。结果提示PD-L1通过与TOP2A形成复合物抵抗奥拉帕尼诱导的凋亡。9、下调p53（R273H）突变蛋白表达增加PARP抑制剂的敏感性。p53 si RNA转染MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞下调p53蛋白表达,MTT法结果显示在MDA-MB-231（R280K突变）细胞中下调p53蛋白表达不改变奥拉帕尼的敏感性,而在MDA-MB-468（R273H突变）细胞中下调p53蛋白表达增加奥拉帕尼敏感性。应用si RNA下调p53（R273H）突变蛋白表达,流式细胞术结果显示奥拉帕尼作用于p53 si RNA干扰的MDA-MB-468细胞,可使细胞凋亡增加。10、过表达p53（R273H）突变降低PARP抑制剂敏感性。在p53野生的MCF-7细胞中转染p53（R273H）突变质粒,MTT结果显示在MCF-7细胞中过表达p53（R273H）突变蛋白降低奥拉帕尼敏感性。11、p53（R273H）突变上调FOXM1的表达。p53 si RNA转染MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞下调p53蛋白表达,蛋白免疫印迹结果显示在MDA-MB-231（R280K突变）细胞中下调p53蛋白表达不改变FOXM1蛋白表达,而在MDA-MB-468（R273H突变）细胞中下调p53蛋白表达下调FOXM1蛋白表达。在p53野生的MCF-7细胞中转染p53（R273H）突变质粒,蛋白免疫印迹法证实过表达p53（R273H）突变后上调FOXM1蛋白表达。12、下调FOXM1蛋白表达增加PARP抑制剂敏感性。FOXM1si RNA转染MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞下调FOXM1蛋白表达,MTT结果显示在这两种细胞系中下调FOXM1蛋白表达都可以增加奥拉帕尼敏感性,与p53突变位点无关。通路富集分析提示FOXM1靶基因参与细胞周期、DNA复制及修复等通路,这些靶基因中,ATR、Top BP1、Chk1、RAD51和BRCA2与FOXM1存在共表达。用FOXM1 si RNA转染MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞下调FOXM1蛋白表达,蛋白免疫印迹和RT-q PCR实验结果显示,si RNA下调FOXM1蛋白表达后,两种细胞系中ATR、Top BP1、Chk1、磷酸化Chk1、RAD51和BRCA2蛋白和m RNA水平呈现下调趋势。结果表明,FOXM1降低PARP抑制剂的敏感性,而p53（R273H突变）通过上调FOXM1的表达降低乳腺癌细胞对PARP抑制剂的敏感性。13、再激活突变p53增加PARP抑制剂的疗效。在p53（R273H）突变的MDA-MB-468细胞中联合应用p53再激活剂APR-246和奥拉帕尼,MTT实验和流式细胞术显示奥拉帕尼联合APR-246作用于MDA-MB-468细胞,与单药奥拉帕尼相比,增强肿瘤抑制作用,使细胞凋亡增加。结论:1、FEN1表达与HRD评分负相关,FEN1高表达降低BRCA野生型三阴性乳腺癌对PARP抑制剂的敏感性;2、FEN1与ATG5结合促进自噬,活化ATR/Chk1通路增强同源重组修复,降低PARP抑制剂敏感性;3、FEN1通过上调PD-L1表达,促进PD-L1与TOP2A形成复合物,抵抗PARP抑制剂诱导的凋亡;4、FEN1抑制剂与PARP抑制剂在BRCA野生型乳腺癌中有合成致死作用;5、p53（R273H）突变可以通过上调FOXM1降低PARP抑制剂的敏感性;6、在p53突变乳腺癌中联合p53激活剂增加PARP抑制剂的疗效。