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程序性细胞死亡因子4对胰腺癌生长抑制作用的实验研究研究目的胰腺癌的发生和发展是一个多基因参与、多阶段累加的过程，一些肿瘤基因和肿瘤抑制基因参与了胰腺癌的发生、发展以及凋亡的过程。程序性细胞死亡因子4（Programmed Cell Death，PDCD4）是一个新发现的与细胞凋亡相关的肿瘤抑制基因，在包括肺癌、肝癌以及乳腺癌在内的多种恶性肿瘤中表达下降，并影响着肿瘤的发生发展。关于PDCD4在胰腺癌中的表达，以及与细胞凋亡的关系，国内外未见相关报道。因此，我们拟从诱导细胞凋亡的角度出发，阐明PDCD4诱导胰腺癌细胞凋亡的信号转导机制，并进一步探讨对5-FU抗肿瘤作用的影响，为联合应用基因治疗和化学疗法治疗胰腺癌，提供新的思路和方法。研究方法1．应用免疫组化S-P法和Western blotting法分别检测69例人胰腺癌石蜡组织切片和8例冷冻保存的新鲜胰腺癌组织中PDCD4的表达水平，探讨其与肿瘤的分化程度、病理分期等临床病理参数的关系。2．应用人胰腺癌细胞系PANC-1，转染PDCD4表达质粒PEGFP-N1／PDCD4及空载体质粒PEGFP-N2，提取细胞质蛋白，应用Western blotting法检测PDCD4和细胞色素C（Cyt.C）表达。同时行DNA ladder凝胶电泳分析，进行凋亡检测。3．转染细胞培养到对数生长期，依次加入不同浓度的5-氟尿嘧啶（5-FU），应用MTT法进行细胞生长抑制实验，计算细胞存活率。同时应用Hoechest 33342荧光染料染色，用荧光显微镜观察，进行凋亡计数。再提取细胞质蛋白，应用Western blotting法检测细胞色素C（Cyt.C）表达水平。研究结果1．Western印迹分析：Western印迹检测8例配对胰腺癌及癌旁正常胰腺组织的PDCD4蛋白表达情况结果显示，同癌旁正常胰腺组织相比，所有胰腺癌组织PDCD4蛋白表达均明显减弱或缺失。2．免疫组织化学染色：在正常胰腺组织中，阳性细胞比例均在80％以上。在69例胰腺癌组织中，PDCD4表达明显下降，且表达水平出现明显差异。在不同分化程度胰腺癌组织之间PDCD4表达存在明显差异，随着分化程度下降，表达明显下调。3．Western blotting检测转染细胞PDCD4和Cyt.C水平，结果示与对照组相比，转染组表达明显增高。4．DNA ladder凝胶电泳分析，转染组见典型的凋亡梯形带，说明出现细胞凋亡。5．MTT法结果显示，随着5-FU浓度升高，PANC-1活细胞比率下降。与对照组相比，在相同浓度的5-FU作用下，转染组活细胞比率明显下降，出现明显的细胞生长抑制。6．凋亡细胞计数显示，随着5-FU浓度升高，PANC-1凋亡细胞比率增高。与对照组相比，在相同浓度的5-FU作用下，转染组凋亡细胞比率明显增高。7．Western blotting检测相同浓度作用下的5-FU，转染组细胞质蛋白的Cyt.C表达水平明显高于对照组。结论1．胰腺癌组织中PDCD4蛋白表达下降，并与癌组织分化程度密切相关，随着分化程度下降，表达明显下调。2．转染组细胞质Cyt.C表达水平增高，说明PDCD4能够通过线粒体途径促进或诱导胰腺癌细胞凋亡。3．PDCD4能够通过线粒体途径，增强5-FU的诱导胰腺癌细胞凋亡的作用。