目的:(1)研究rrbp1a和rrbp1b基因在非洲爪蛙早期胚胎发育过程中的时空表达规律;敲降和过表达rrbp1基因对早期胚胎发育的影响,并建立rrbp1基因敲除爪蛙模型。(2)探索基于CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞水平以及热带爪蛙整体动物水平进行靶基因替换的技术。方法:(1)爪蛙rrbp1基因表达模式研究:(1)利用人源RRBP1蛋白的氨基酸序列在非洲爪蛙(Xenopus laevis)数据库中进行blast分析,检索非洲爪蛙RRBP1蛋白的氨基酸序列;(2)通过基因克隆及RNA体外转录等分子生物学技术制备用于胚胎整体原位杂交的RNA探针;(3)利用RT-PCR技术、整体原位杂交技术和振动切片技术,分析rrbp1a和rrbp1b基因在非洲爪蛙早期胚胎发育过程中的时空表达模式;(4)利用RT-PCR技术分析rrbp1a和rrbp1b基因在成体非洲爪蛙不同组织中的表达规律;(5)利用Morpholin(MO)显微注射及m RNA显微注射技术,敲降及过表达rrbp1基因,结合形态学分析技术,研究靶基因对早期胚胎发育的影响;(6)通过筛选出对靶位点敲除效率较高的sg RNA,体外转录Cas9 m RNA,应用显微注射技术将CRISPR/Cas9系统导入热带爪蛙的受精卵,在基因组水平对rrbp1基因进行敲除,通过传代对阳性突变体进行筛选,从而构建纯合敲除rrbp1基因的热带爪蛙模型。(2)CRISPR/Cas9介导的基因替换研究:(1)体外研究:以3T3细胞及小鼠FSP1基因(m FSP1)为研究对象,在靶基因的启动子区域设计并筛选有效的sg RNA位点,结合基于bait及同源臂的donor载体设计策略,将donor与CRISPR/Cas9系统共转染细胞,结合报告基因(EGFP)检测,在细胞水平上探索利用CRISPR/Cas9技术进行靶基因精确替换的可行性;(2)体内研究:通过在热带爪蛙Myh6靶基因5?UTR区域以及起始密码子区域和KDR靶基因5?UTR以及启动子区域设计sg RNA位点,结合基于bait及同源臂的donor载体设计策略,利用显微注射技术将donor、Cas9 m RNA和sg RNA共同注射到爪蛙受精卵,将其培养到45期,通过荧光体视显微镜进行报告基因检测,并通过genometyping及sequencing技术分析报告基因的定点插入情况,进而在活体动物水平探索体内精确替换靶基因的可行性。结果:(1)氨基酸序列blast结果表明,非洲爪蛙含有RRBP1A和RRBP1B两个同源蛋白,并且都包含相似的保守结构域;系统进化分析表明,RRBP1蛋白在不同的脊椎动物中也是保守的,与斑马鱼相比,非洲爪蛙RRBP1与人类RRBP1的同源性更高。(2)原位杂交结果表明:在卵母细胞和st2(卵裂期)几乎没有检测到的rrbp1a和rrbp1b基因的表达;在st8(囊胚期)的动物极检测到rrbp1a和rrbp1b微弱表达;st11(原肠胚期)在胚孔周围未检测到rrbp1a的表达,但是检测到rrbp1b的微弱表达;在st21(神经胚期)的脊索中观察到rrbp1a和rrbp1b的高水平表达;从st25到st29的尾芽阶段,rrbp1a在黏腺,体节以及脊索中中度表达;rrbp1b在st26黏腺中表达较为强烈,脊索位置的表达变弱,体节也有微弱的表达;在st32(尾芽期)的黏腺中rrbp1a的表达明显,体节和腹部表达微弱,rrbp1b在黏腺中表达较弱,在体节、听囊和脊索中也有微弱表达;到st36(尾芽期),除了在体节和听囊中微弱表达外,主要在心脏和黏腺以及腹部区域观察到rrbp1a的表达,st36时rrbp1b在心脏中被检测到,此外还在听囊,黏腺,体节和脊索中也检测到其表达;振动切片证实rrbp1在st36胚胎心原肌,脊索,听囊和肠都有表达,在表皮中也检测到了rrbp1b的信号。当使用正义链的RNA探针对以上各时期进行原位杂交时,都没有检测到靶基因的表达。(3)RT-PCR分析结果表明:从卵母细胞到st4检测到非常弱的rrbp1a表达,然后从st8到st37的表达逐渐增加,然而,rrbp1a的表达在st39下降。Rrbp1b在卵母细胞时期并未检测到,从st2时开始一直到st17时表达量都较低,从st19开始到st39检测到表达较强。(4)在所有检测的成体组织中都检测到rrbp1基因的表达。在脾脏中检测到rrbp1a的表达最强,在心脏中表达最弱,在肾脏中rrbp1b的表达最强,而在其他组织中表达稍弱。(5)过量表达rrbp1基因对爪蛙的早期发育没有显著性影响;利用MO进行基因敲降时,注射不同量的MO对其发育的影响不同,当MO注射量高时(15 ng)所引起的畸形率也较高(92.1%)。(6)通过传代对敲除rrbp1基因的阳性突变体进行筛选,获得敲除rrbp1基因的纯合突变体(在第一个外显子的52bp处引入移码突变)。(7)利用CRISPR/Cas9系统及donor载体,通过对3T3细胞的FSP1基因启动子区域的基因打靶,发现报告基因EGFP被敲入到基因组,可检测绿色荧光,但是效率较低(4.1%),经过传代后荧光未丢失。(8)利用CRISPR/Cas9系统在热带爪蛙Myh6和KDR基因的5?UTR和启动子区域进行的基因敲入,未检测到报告基因(EGFP)的表达;然而,针对Myh6基因起始密码子位点设计的sg RNA,结合基于同源重组的donor载体设计策略,能在爪蛙心脏及肌肉组织中特异性的检测到报告基因的表达,不同的sg RNA及其不同组合,报告基因的敲入效率并不相同。结论:(1)生物信息学分析表明,非洲爪蛙含有RRBP1A和RRBP1B两个同源物,其编码基因分别命名rrbp1a(NM＿001089623.1)和rrbp1b(NM＿001092468.1)。原位杂交及RT-PCR分析提示,在早期胚胎发育过程中及成体组织中rrbp1a及rrbp1b基因具有不同的时空表达模式。过量表达rrbp1基因对爪蛙的早期发育没有显著性影响。MO敲降rrbp1基因后,对爪蛙早期胚胎发育产生影响,胚胎出现头部和胸部肿大,最高的畸形率为92.1%。通过对阳性突变体进行传代筛选,已获得敲除rrbp1基因的热带爪蛙纯合子。(2)利用CRISPR/Cas9系统及donor载体设计策略,能实现在3T3细胞FSP1基因启动子区域插入外源基因,并可实现外源基因的表达。对于热带爪蛙Myh6和KDR基因的5?UTR区域设计靶位点进行基因敲入,未检测到报告基因与靶基因的精确替换。然而,针对Myh6基因起始密码子位点的基因编辑策略,成功在爪蛙心脏及肌肉组织中检测到报告基因的特异性表达,且不同sg RNA及其不同组合所产生的报告基因敲入效率并不相同。从而初步证实了利用CRISPR/Cas9系统在动物体内实现靶基因精确替换的可行性。