肠炎沙门氏菌对鸡细胞自噬的影响及其Fe3O4-MNP调控作用研究

来源 :中国农业科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:colinvin
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本试验旨在从细胞自噬角度研究四氧化三铁磁性纳米粒子(Fe3O4 Magnetic Nanoparticles,Fe3O4-MNP)对禽源细胞肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis,SE)感染结局的调控作用。试验一:肠炎沙门氏菌感染诱导LMH细胞自噬的研究。选择鸡肝癌细胞(LMH细胞)为研究对象,构建了SE感染模型。于感染后24 h(24 hours post infection,24 hpi)收集细胞,以透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)和Western-blot(WB)方法检测自噬的发生情况,结果表明:SE SC070株感染条件为感染剂量5×107 cfu/mL、感染时间1 h时,大部分LMH细胞都有SE侵入,而细胞状态不受太大影响,未出现细胞质松散或细胞崩解;TEM结果显示,SE感染组LMH细胞内可见大量包裹SE的的自噬结构,而对照组LMH细胞内未见明显自噬结构;WB结果显示SE感染组LC3-II/β-actin比值显著高于对照组(P<0.05),p62/β-actin比值极显著低于对照组(P<0.01)。试验二:Fe3O4-MNP对肠炎沙门氏菌的调控作用。在SE SC070株感染LMH细胞后,添加不同剂量(50、100、200、400μg/mL)的Fe3O4-MNP进行处理,同时设置不添加Fe3O4-MNP处理的对照组。于感染后不同时间点收集LMH细胞,通过CCK-8法检测细胞活性,平板计数法计数胞内菌数量。结果显示:6 hpi时,与对照组相比,各剂量的Fe3O4-MNP处理均对胞内菌数量无显著影响(P>0.05),200μg/mL和400μg/mL两组显著降低了细胞活性(P<0.05);12 hpi时,与对照组相比,各剂量的Fe3O4-MNP处理均极显著降低了胞内菌数量(P<0.01),100μg/mL组有增加细胞活性的趋势(P>0.05),50μg/mL和200μg/mL两组对细胞活性无显著影响(P>0.05),400μg/mL组显著抑制了细胞活性(P<0.05);18 hpi时,与对照组相比,各剂量Fe3O4-MNP均极显著降低了胞内菌数量(P<0.01),50μg/mL组对细胞活性无显著影响(P>0.05),而100、200和400μg/mL三组均极显著降低了细胞活性(P<0.01);24 hpi时,与对照组相比,各剂量Fe3O4-NPs均极显著降低了胞内菌数量和细胞活性(P<0.01),且剂量为400μg/mL时最低;30hpi时,与对照组相比,各剂量Fe3O4-MNP均极显著降低了胞内菌数量和细胞活性(P<0.01),且剂量越大,胞内菌数量越少,细胞活性越弱。试验三:自噬在Fe3O4-MNP调控肠炎沙门氏菌感染中的作用研究。在SE SC070株感染LMH细胞后,添加100μg/mL的Fe3O4-MNP进行处理(SN组),同时设置不添加Fe3O4-MNP处理的对照组(SE组)。于12 hpi收集细胞,以TEM和WB方法检测自噬的发生情况,结果表明:WB结果显示SN组LC3-II/β-actin比值显著高于SE组(P<0.05),p62/β-actin比值显著低于SE组(P<0.05);TEM结果显示,与SE组相比,SN组胞浆内除了可见包裹SE的自噬结构外,还可见包裹SE和Fe3O4-MNP的自噬结构。综上所述:本试验中SE感染模型构建的合适条件为:感染剂量为5×107 cfu/mL,细菌和细胞共培养1 h;SE感染能够诱导禽源细胞LMH发生自噬。Fe3O4-MNP能够缓解LMH细胞SE感染,且剂量为100μg/mL,时间为12 h时,作用效果最佳。Fe3O4-MNP能够通过促进细胞自噬而缓解LMH细胞SE感染。
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