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背景:由于耳软骨是一种乏血管、神经及淋巴结构的组织,它自我更新、再生的能力非常有限。耳廓外伤、肿瘤切除及先天发育畸形等常遗留耳廓缺陷及畸形。目前临床主要通过雕刻肋软骨制成耳廓支架。但由于自体软骨来源有限、手术范围增大、供区并发症等,其应用受到一定限制。组织工程软骨一直以来都是研究的热点及难点。目前软骨细胞外基质已证实具有促细胞黏附、增殖、分化的功能,但是纯软骨基质构成的支架机械性能差。我们将软骨基质与丝素蛋白结合,利用3D打印技术,探索脱细胞软骨外基质构建组织工程耳软骨的应用策略。目的:1.脱细胞软骨外基质(ECM)与丝素蛋白(SF)进行γ交联制作软骨支架,结合脂肪干细胞构建组织工程软骨的可行性研究:探讨γ交联制备的软骨支架是否促进脂肪干细胞黏附、增殖、分化,形成软骨样组织。2.利用3D打印技术及倒模法构建内部交通的ECM-SF支架,结合脂肪干细胞(ADSC),探讨该方法构建的组织工程软骨是否更优于普通γ交联的支架,更接近正常软骨组织。3.探索耳软骨及肋软骨来源的软骨细胞接种于PCL支架后,脱细胞制成的软骨支架结合ADSC是否能成功构建组织工程软骨。方法:1.将猪耳软骨进行脱细胞处理,获得的ECM与SF进行伽马γ交联,获得ECM-SF支架及单纯的SF支架,应用扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察支架结构。分离提取猪耳软骨细胞(Chondrocytes,Chon)、猪ADSC。评价支架细胞毒性,使用支架浸泡液培养细胞。分别将猪Chon P2、ADSC P2接种于ECM-SF支架及SF支架。组织学切片染色观察软骨形成情况。2.用3D打印系统打印PCL支架,使用1中方法提取ECM、SF,将二者混合后压入PCL支架,γ交联冻干后,用有机溶剂溶化PCL支架,获得倒模法3D ECM-SF支架(indirect 3D ECM-SF scaffold,i3D ECM-SF)。同时以相同的方法,制备倒模法3D SF支架(indirect 3D SF scaffold,i3D SF)。SEM观察支架结构。支架浸泡液培养P2猪ADSC,CCK—8评价支架细胞毒性。分别将猪Chon P2、ADSC P2接种于i3D ECM-SF支架及i3D SF支架。组织学切片染色观察软骨形成情况。3.用3D打印系统打印PCL支架。分离提取猪耳软骨细胞(AuricularChondrocytes,AuChon)、肋软骨细胞(Costal Chondrocytes,CoChon),人脂肪干细胞(human Adipose-derived stem cells,hADSC)。于 PCL 支架上接种P2的AuChon、CoChon,培养10天后进行脱细胞处理,获得脱细胞软骨基质-PCL 支架(decellularized ECM-PCL scaffold,deECM-PCL)。两种支架分别接种hADSC,观察细胞黏附及软骨形成情况。结果:1.γ交联支架制备法安全无毒。ECM-SF支架较SF支架更有利于ADSC黏附、增殖,分泌软骨特异性细胞外基质成分。两种支架内部均存在中空现象。2.通过倒模法制备的i3D ECM-SF支架无细胞毒性,有利于细胞黏附及增殖。以i3D ECM-SF+ADSC组形成的软骨组织最为致密、均一;i3D SF+ADSC组组织生长良好,但未见成熟的软骨组织,而i3D SF+Chon组细胞成分较少,组织生长欠佳。3.猪软骨细胞在PCL支架上黏附、生长,经脱细胞处理后,可去除抗原成分,降低免疫原性,保留胞外基质。相比未处理的PCL支架,deECM-PCL支架可促进细胞黏附、增殖。结论:1.γ交联的方法制备的ECM-SF支架无细胞毒性,有利于细胞黏附及增殖,可形成成熟的软骨组织。但由于支架内部的沟通较小,可能阻碍了营养物质、氧气的交换,不利于细胞长入支架中心。2.倒模法制备的i3D ECM-SF支架无细胞毒性,有利于细胞黏附及增殖,可形成成熟的软骨组织。PCL溶化后留下的通道提高了支架内部交通性,与普通的支架相比,更有利于液体渗透,使细胞更容易长入支架中心,进而形成成熟、均质的软骨组织。3.将软骨细胞接种到PCL支架后,进行脱细胞处理,可使PCL支架包裹上细胞来源的ECM。相比未处理的PCL支架,包裹细胞外基质的PCL支架更有利于ADSC黏附。