冠突散囊菌(Eurotium cristatum EC),是茯砖茶在特定温湿度条件下,通过“发花”工艺长成的自然益生菌体,俗称“金花”,具有较好的抗氧化、抗菌和抗肿瘤等功能,但这些功能的研究主要基于固体发酵和菌种鉴定,为了更深入的研究冠突散囊菌液体发酵条件的优化及其活性,论文探究了培养基的碳源,氮源因素对发酵的影响,并且通过单因素实验,正交实验,响应曲面实验等确定冠突散囊菌的最优发酵条件。后续对其发酵产物进行初步的细胞毒活性评价,为筛选抗肿瘤活性天然药物提供理论基础。最后通过RT-QPCR试验和ELISA试剂盒检测细胞因子等一些试验方法来对冠突散囊菌粗提物进行免疫活性的初步研究。为菌种的发酵及免疫活性研究提供理论依据。实验内容及结果:1确定冠突散囊菌发酵条件中的最佳碳源和氮源冠突散囊菌液体发酵中碳源选用乳糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉等六种碳源。氮源选用蛋白胨LP0037、LP0021、硫酸铵、玉米粉、酵母粉、甜菜碱等六种氮源。通过菌种摇瓶发酵,装液量100 mL,接种量5%,发酵温度为28℃,转速200 r/min,摇床培养6天、8天、10天、12天,通过测定发酵液的免疫活性为单一指标,确定最佳的发酵培养基碳源为可溶性淀粉,氮源为玉米粉,且均在发酵第8天时免疫活性最好。2通过单因素实验,正交实验对发酵条件进行优化以可溶性淀粉为最佳碳源,玉米粉为最佳氮源,以磷酸二氢钾,七水硫酸镁为无机盐,以发酵液菌丝体干重为指标,确定最佳发酵原料配方。以发酵温度、pH、接种量、装液量、发酵时间等五种因素确定最佳的条件,通过摇瓶发酵,250 mL摇瓶装液量100 mL,接种量5%,转速200 r/min,摇床培养8天,测定其发酵液免疫活性及菌丝体干重,单因素实验结果表明分别为温度为25℃,pH为6,装液量为100 mL,接种量为8%,发酵时间为10天时,菌丝体干重最高。通过前面单因素实验的设计五因素四水平的正交实验,结果表明:在实验范围内,各因素对冠突散囊菌发酵条件影响的因素程度依次为发酵时间>发酵温度>接种量>装液量>初始pH。3应用响应曲面法优化冠突散囊菌的发酵条件为了进一步优化冠突散囊菌的发酵条件,以菌丝体干重和发酵液的免疫活性为考核指标,采用响应曲面法对发酵工艺中冠突散囊菌的接种量,装液量,发酵温度,发酵时间四个主要条件进行优化实验。结果显示通过响应曲面法优化的发酵工艺稳定性好,最终确定冠突散囊菌发酵工艺条件为发酵温度为24.04℃,发酵天数9.27天,装液量106.54 mL,接种量8.93%时,利用数学模型分析得知最佳的菌丝体重量为最大值0.923g。对该工艺验证的结果为检测得到三瓶菌丝体重量分别为0.875 g,0.911 g,0.862 g。平均值为0.883 g,方差为0.0254,与预测值的绝对偏差<1%,这表明实验结果与模型预测较为吻合。4冠突散囊菌发酵粗提物的细胞毒活性评价以A549(人肺癌细胞),B16(小鼠黑色素瘤细胞),SW480(人结肠癌细胞),U251(人胶质瘤细胞)等四种细胞为实验对象对冠突散囊菌抑制肿瘤细胞的作用进行了筛选。结果表明冠突散囊菌发酵粗提物对四种肿瘤细胞均有一定的抑制作用,其中对人结肠癌SW480细胞抑制效果最好。5冠突散囊菌发酵液粗提物免疫活性的初步研究以小鼠巨噬细胞RAW264.7为模型,对冠突散囊菌发酵液粗提物的免疫活性进行初步研究。发酵液粗提物作用于免疫细胞RAW264.7进行活性追踪,发现对细胞具有一定的增殖效果。之后利用内毒素试剂盒进行内毒素检测,发现药物中不含有内毒素。排除内毒素干扰后进行下一步的免疫活性研究,分别从基因调控和免疫细胞因子表达的水平上评价冠突散囊菌发酵液粗提物的免疫活性。通过RT-QPCR实验检测发现,INOS(一氧化氮合酶),TNF-α(肿瘤坏死因子),IL-6(白介素)基因的表达相比较与正常组,都有上调的趋势,且与药物浓度之间存在着剂量效应关系。通过用ELISA检测试剂盒,检测免疫细胞中释放的细胞因子IL-6,IL-1β(白介素1β),TNF-α的释放量。细胞因子IL-6,IL-1β的释放量相比于正常组有较多,但释放量不显著,且与药物浓度之间没有明显的计量效应关系。当药物浓度在6.25μg/ml到50μg/ml时,细胞促进TNF-α的释放量随着浓度的增大而减少,当药物浓度在100μg/ml时,细胞促进TNF-α的释放量又呈现上升趋势,与空白对照组相比,细胞促进TNF-α的释放量比较显著。细胞促进TNF-α的释放量与药物浓度之间没有明显的剂量效应关系。