冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease,CAD）是最常见的心血管疾病。随着全球范围内人口老龄化加剧,尽管在预防性用药广泛应用的背景下,冠状动脉粥样硬化病变导致的缺血性心肌病（Ischemic cardio-myopathy,ICM）发病率仍逐年升高,急性心肌梗死的死亡率总体呈上升趋势。尽早恢复血流灌注是治疗心肌缺血的最有效策略,然而在尚未血运重建之前,如何挽救存活心肌及减少细胞缺氧损伤是治疗缺血性心肌病的关键方向。同时,冠状动脉粥样硬化病变引起的血管狭窄是导致缺血性心肌病的罪魁祸首,如何减缓冠脉粥样硬化病变进展及逆转血管狭窄成为当今心血管领域亟待解决的重大问题。因此,系统性阐述冠脉粥样硬化细胞组成及微环境,全面描绘参与疾病进展的重要细胞种类及功能,对明确粥样硬化发病机制和探索有效干预靶点提供了重要理论依据。在心肌细胞缺氧的早期阶段,心肌细胞膜结构破坏是最先出现的超微结构变化,最早可在缺血发作后10-15分钟出现。肌膜结构功能的完整性对于心肌细胞的命运至关重要。因此,早期干预维持肌膜结构的完整性成为心肌保护的一大方向。作为心肌细胞膜结构及电生理活动的重要组成部分,膜连接复合物（Junctional Membrane Complexes,JMCs）是维持心肌细胞功能的重要结构单元。因此,本研究的第一部分探索了 JMCs重要组成蛋白之一——NEXN在心肌缺血过程中的表达改变以及其在维持心脏收缩功能的应用探索。此外,由于NEXN在心肌组织中表达丰度较高,且表现为肌组织特异性表达,因此,本研究也初步探索了其作为缺血性心肌病候选标志物的应用可能。冠状动脉粥样硬化疾病涉及多种细胞参与,在不同病理时期存在复杂的细胞转化。既往研究仅针对部分细胞在疾病进展的功能变化,缺乏对冠脉粥样硬化病变的全景描述,未能系统性阐明参与病变的关键细胞类型。伴随着单细胞技术的出现,使我们对组织细胞亚型的分析达到了空前的分辨率。因此,本研究第二部分对人冠状动脉粥样硬化组织进行单细胞转录组分析,发挥不同单细胞平台优势,进一步全面的对冠脉粥样硬化进行描述,并利用生物信息学方法对疾病进展过程显著变化的细胞类型进行细化分析。综上所述,本研究围绕冠心病的机制探索及单细胞技术在心血管疾病中的应用,具体两部分研究内容摘要如下:第一部分:NEXN在维持心脏收缩功能及其作为缺血性心肌病候选蛋白标志物的研究背景:心肌细胞发挥正常功能依赖于其高度精细化的亚细胞结构,其中膜连接复合物（Junctional Membrane Complexes,JMCs）是心脏正常兴奋收缩偶联的关键结构。JMCs结构/功能取决于其组成蛋白如JPH2,BIN1,CAV3以及NEXN等,它们在调控JMCs的位置和功能活性方面发挥重要作用。JMCs在病理过程中可以表现出代偿性重塑,但随着JMCs结构降解会导致心肌收缩力的受损及心律失常出现,进而导致心脏功能的失代偿及心力衰竭的发生。NEXN作为新发现的JMCs组成蛋白,其在心肌缺血损伤中的作用有待进一步探索。方法:通过缺血性心肌病RNA-seq数据及人心脏单细胞数据,探索NEXN在缺血性心肌病中的表达特点。利用体内体外模型检测心肌缺血NEXN的表达改变,进而借助不同的过表达方式探索上调NEXN对心脏收缩功能的影响。利用RNA-seq及TMT定量蛋白组学方式探索过表达NEXN导致的通路功能改变。检测体内外缺氧状态NEXN的表达模式,探索其作为缺血性心肌病候选蛋白标志物的应用前景。结果:通过缺血性心肌病转录组数据发现NEXN在心脏心肌细胞中显著高表达,并在疾病过程中表达下调,体内外缺血缺氧实验证实NEXN随缺血时间延长表达逐渐降低。通过对原代心肌细胞利用腺相关病毒（AAV）心脏特异性表达载体,构建在体NEXN上下调模型,我们发现在成年大鼠生理状态下下调NEXN导致心脏收缩功能减弱,成像实验发现NEXN表达下调导致心肌细胞结构紊乱。进而在心脏缺血模型研究中发现,预先干预NEXN（上调）可以在一定程度减轻缺血损伤,维持心脏收缩功能。进而,我们通过转录组联合蛋白组测序,发现上调NEXN,差异基因富集分析提示与钙离子通道,心肌收缩,肌膜稳定性及转录活性调控相关,通过生物信息学分析发现NEXN上调可导致其蛋白调控网络中Rho/Rock通路关键蛋白（Rho家族,Rhoa,Rhoc）表达并过抑制Rho/ROCK途径降低心肌细胞凋亡和炎症反应。进一步针对NEXN体内外缺氧损伤状态释放模式研究发现,NEXN在心脏损伤时释放,较基线水平变化程度较高,是理想的缺血性心肌病候选蛋白标志物之一。结论:NEXN随心肌缺血表达下调,随缺血时间延长逐渐释放,并在外周血中可稳定检测。体内外功能实验表明NEXN表达有助于维持心肌细胞结构和功能。此外,转录组联合蛋白组发现上调NEXN有助于心肌收缩、钙离子通道功能及膜结构稳定,并可能通过抑制Rho/ROCK途径降低心肌细胞凋亡和炎症反应,从而起到心肌保护作用。第二部分:冠状动脉粥样硬化斑块细胞组成及微环境的单细胞分析背景:动脉粥样硬化疾病进展涉及多种细胞共同参与,不同病理时期细胞比例及转化过程十分复杂,其中关键细胞类型及其功能尚不明确。尽管在小鼠和人类其他动脉组织研究了动脉粥样硬化的细胞异质性,但是具体人类心脏冠状动脉的细胞组成尚不清楚。本研究借助单细胞转录组测序结合冠心病GWAS数据,详细描述人类冠状动脉粥样硬化细胞亚群分布,并对影响疾病进展关键细胞类型进行细化功能分析。方法:采集心脏移植患者受体心脏冠状动脉组织,进而酶解消化冠脉组织获得单细胞悬液,应用两种测序平台进行单细胞转录组测序,利用组织病理学、免疫荧光及流式细胞术结合生物信息学分析细胞亚群功能及类型。结果:通过单细胞测序研究了来自25位心脏移植患者受体心脏的69份冠脉组织共72554个细胞进行单细胞测序。通过生物信息学分析明确了代表8种主要冠状动脉细胞类型的34种亚群:血管平滑肌细胞（6个亚群）,成纤维细胞（6个亚群）,巨噬细胞（5个亚群）,T细胞（4个亚群）,内皮细胞（5个亚群）,NK细胞/肥大细胞（3个亚群）,肌成纤维细胞（3个亚群）,以及B/浆细胞（2个亚群）。间质细胞（血管平滑肌细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞）构成冠状动脉的主要成分,其次是巨噬细胞,T细胞,内皮细胞,NK细胞等。通过比较不同病理分期的细胞组成变化,发现了一些随疾病变化免疫细胞亚群以及间质细胞亚群。间质细胞存在随疾病进展的广泛细胞间转化过程,而免疫细胞中可能存在特殊的T细胞亚群影响斑块损伤修复过程。通过细胞间通讯分析发现,内皮细胞和巨噬细胞间通讯占疾病进展阶段的主导地位。特定细胞亚群HGF-MET作用增强可能与斑块组织损伤修复相关。GWAS研究发现的冠心病相关的易感基因联合分析,发现易感基因主要富集于巨噬细胞、成纤维细胞,联合冠脉粥样硬化质谱数据发现早期上调蛋白富集于肌成纤维细胞细胞,而晚期上调蛋白在巨噬细胞中明显富集。深入了解疾病进展过程中关键细胞类型功能变化对于有效干预动脉粥样硬化的疾病进展至关重要。结论:本研究通过对人类冠状动脉组织的单细胞全景描画,并对不同疾病进展阶段的细胞组成进行了表征。我们的结果可作为人类冠脉粥样硬化病变过程的高质量单细胞数据库,有助于探索针对该类疾病治疗靶点的研究。