论文部分内容阅读
干旱、低温、高盐等非生物胁迫是影响植物生长发育的重要因素,直接决定了产量的形成,世界主要农作物每年50%的损失量与此有关。紫花苜蓿（Medicago sativa）是营养丰富、产量高、应用广泛的重要牧草,但非生物胁迫会严重降低其产量和品质。多种抗逆功能基因被发现并应用于植物应答非生物胁迫中,胚胎晚期富集蛋白（Late embryogenesis abundant,LEA）就是其中发挥重要功能的抗逆功能基因。为了研究紫花苜蓿MsLEA4基因的抗逆性功能,本研究从紫花苜蓿中成功克隆出MsLEA4-4基因,并进行生物信息学分析,同时通过农杆菌介导法将其转入拟南芥（Arabidopsis thaliana）中进行了抗逆性功能研究。获得主要研究结果如下:1、采用RACE-PCR的方法从“中苜1号”紫花苜蓿叶片基因组中克隆出MsLEA4-4基因。c DNA序列含有一个498 bp的开放阅读框（Open reading frame,ORF）,编码166个氨基酸;DNA序列总长1001 bp,含有2个外显子和1个503 bp的内含子序列;对氨基酸序列进行分析,发现缺少半胱氨酸和色氨酸,有5个重复的由11个氨基酸序列TAQAAKEKTQQ组成的序列;序列比对分析与蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、红三叶（Trifolium pratense）等相似性较高,进化树分析显示与蒺藜苜蓿Mt LEA4-4基因聚为一类,因此命名为MsLEA4-4。MsLEA4-4氨基酸序列中存在大量α基螺旋,多数氨基酸数值都位于0以下,是亲水性氨基酸。构建PA7-MsLEA4-4-GFP表达载体,通过基因枪法转入洋葱（Allium cepa）表皮细胞,亚细胞定位结果显示MsLEA4-4基因定位于细胞核。结构分析结果显示MsLEA4-4基因可能会有抗逆功能。2、根据所获得的MsLEA4-4基因ORF序列,采用染色体步移法从紫花苜蓿基因组中克隆到490 bp的MsLEA4-4基因的启动子序列。对启动子序列结构进行分析,结果显示含有3个响应脱落酸（Abscisic acid,ABA）调控的顺式作用元件ABRE,1个响应赤霉素（Gibberellic acid,GA）调控的顺式作用元件P-box,2个参与胚乳合成的顺式作用元件,10个参与光调控的顺式作用元件和1个与光周期调控相关的顺式作用元件。3、qRT-PCR法检测MsLEA4-4基因在紫花苜蓿荚果和种子中的表达量最高。将MsLEA4-4基因启动子序列插入pCAMBIA1301表达载体中,构建MsLEA4-4::pCAMBIA1301表达载体,通过农杆菌介导法转入拟南芥,β-葡萄糖苷酸酶基因（Glucosidase,GUS）染色结果显示MsLEA4-4基因启动子只在拟南芥花和角果中表达。表明MsLEA4-4基因是种子特异性表达基因。4、根据MsLEA4-4基因启动子中的顺式作用元件,对紫花苜蓿进行低温、干旱、盐、重金属、不同光照时间胁迫以及外源激素处理,qRT-PCR结果显示各逆境胁迫和外源激素均能诱导MsLEA4-4基因的表达。表明MsLEA4-4基因可能参与紫花苜蓿的多种抗逆性调控,并协同ABA代谢途径参与紫花苜蓿的逆境调控和光周期调控。5、构建pCAMBIA3301-MsLEA4-4超表达载体,采用农杆菌介导法转化拟南芥,用RT-PCR、草胺膦（DL-Phosphinothricin,PPT）筛选以及3∶1性状分离等方法检测转基因拟南芥株系,获得7个阳性转基因株系,通过qRT-PCR筛选出3个表达量较高的株系OE1、OE4和OE8进行干旱、低温、NaCl、H2O2胁迫以及ABA诱导等试验,MsLEA4-4基因过表达株系的发芽率在NaCl胁迫和ABA处理下比野生型（Wild type,WT）拟南芥提高5～12倍;多种逆境胁迫下转基因株系的叶绿素含量和单株生物量显著高于WT;且NaCl胁迫下转基因株系的存活率比WT高4～5.3倍;转基因株系比WT拥有更多的侧根。对多种逆境胁迫后转基因株系的抗氧化酶活性分析,结果显示转基因株系体内的可溶性糖含量,超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）,过氧化氢酶（Catalase,CAT）,过氧化物酶（Peroxidase,POD）活性显著高于WT,脯氨酸（Proline,Pro）和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量显著低于WT。6、分析MsLEA4-4基因过表达株系中ABA代谢途径、Pro代谢途径以及渗透胁迫中相关基因的表达量,结果显示转基因株系中ABF3,ABI5,NCED5,NCED9,P5CS,RD29A基因的表达量显著升高。说明将MsLEA4-4基因转入拟南芥,可能会诱导其它逆境胁迫相关基因的表达,表达基因可能会协同MsLEA4-4提高了转基因拟南芥对各种逆境胁迫的耐受性。研究结果表明MsLEA4-4基因中存在大量α-螺旋,是亲水性氨基酸,启动子序列中存在大量与逆境胁迫相关的顺式作用元件,因此可能具有抗逆功能;MsLEA4-4基因是种子特异性基因;参与紫花苜蓿的多种逆境调控;该基因在拟南芥中过表达,逆境胁迫下转基因植株的生长指标和生理指标均显著高于WT,提高了其抗逆性。