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昆虫杆状病毒是囊膜包裹的双链环状DNA病毒,大部分寄生于鳞翅目、膜翅目、双翅目昆虫,因其形态呈杆状而得名。自上世纪末以来,它作为一种新型杀虫剂逐渐应用于害虫防治。根据杆状病毒在细胞中的分布和包涵体的形态可分为颗粒体病毒属(GV)和核多角体病毒属(NPV)。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)是杆状病毒的模式种,它研究最多也最具代表性。AcMNPV基因组约为130 Kbp,有150多个开放阅读框。杆状病毒的组织蛋白酶存在于核衣壳和囊膜中,可以降解宿主的肌动蛋白,引起细胞骨架的崩溃。杆状病毒具有多个强启动子,常用的有IE1、PH、P10、P6.9、ETL,重组外源基因常受上述启动子调控。BmK IT是东亚钳蝎昆虫毒素,可与昆虫细胞膜的钠离子通道相互作用,它可以导致动作电位的重复发放,使得钠电流增强,钠传导的关闭延缓,最终导致昆虫兴奋性麻痹。蝎昆虫特异性毒素可刺激昆虫可兴奋细胞而造成虫体各系统代谢紊乱,通过重组蝎昆虫特异性毒素提高AcMNPV对农业害虫的防治效果是重要的防治策略。本实验在揭示BmK IT的抗虫活性的基础上,研究基于BmK IT提高AcMNPV抗虫活性的作用机制。本研究主要分为三个部分：(1) AcMNPV介导BmK IT的表达对Sf9细胞增殖及病毒在细胞内复制的影响；(2) BmK IT在AcMNPV不同启动子调控下对Sf9细胞增殖的影响；(3) AcMNPV介导BmK IT与组织蛋白酶协同表达对Sf9细胞增殖的影响。第一部分采用MTT法、TUNEL试剂、Western blots Real-time PCR及病毒滴度测定来检测AcMNPV-BmK IT(IE1)对草地夜蛾卵巢细胞Sf9增殖及病毒在Sf9细胞内的复制情况。用野生病毒AcMNPV和重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)感染Sf9细胞(病毒终浓度为1.52×1010vp/mL(0.6MOI)、1.9×1010 vp/mL (0.8 MOI)、2.5× 1010 vp/mL (1 MOI)和3.8×1010vp/mL(1.5MOI)),24 h后通过MTT法检测到重组病毒AcMNPV-BmKIT(IE1)对Sf9细胞增殖的抑制率分别是野生病毒AcMNPV处理组的2.8倍、2.1倍、2.0倍和2.4倍；用野生病毒AcMNPV和重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)感染Sf9细胞(病毒终浓度为1.29×1010 vp/mL (0.5 MOI)),24 h后用TUNEL试剂盒对细胞凋亡状况进行检测,结果显示重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)处理的Sf9细胞被绿色荧光标记的数量远大于野生病毒AcMNPV处理组,进一步证实重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)促进Sf9细胞的凋亡；分别用野生病毒AcMNPV和重组病毒AcMNPV-K IT(IE1)感染Sf9细胞(病毒终浓度为0.56×1010vp/mL (0.2 MOI)),24 h后进行Western blot检测,重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)处理的Sf9细胞中c-Myc、cleaved-Caspase3、Bax蛋白表达量都有所增加,而Bcl-2蛋白表达量有所减少。用野生病毒AcMNPV和重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)感染Sf9细胞(病毒终浓度为0.56×1010 vp/mL (0.2 MOI)),24 h后Real-time PCR检测四种病毒关键结构蛋白38K、C42、P78和F基因的转录水平,结果表明重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)处理组细胞中四种关键基因的转录水平分别是野生病毒AcMNPV处理组的2.1倍、1.5倍、1.6倍和1.8倍。用野生病毒AcMNPV和重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)感染Sf9细胞(病毒终浓度为1.52×1010 vp/mL (0.6 MOI)、1.9×1010 vp/mL (0.8 MOI)、2.5 × 1010 vp/mL (1 MOI)和3.8×1010vp/mL(1.5 MOI)),24 h后检测病毒粒子滴度,结果显示,与野生病毒AcMNPV相比,重组病毒AcMNPV-BmKIT(IE1)在细胞中的复制子代病毒量分别提高了58.3%、66.7%、70.6% 和42.9%。以上结果显示AcMNPV介导BmK IT的表达在感染细胞前期可加速Sf9细胞的凋亡,并可提高病毒自身的复制能力。第二部分实验利用野生病毒AcMNPV和重组单价病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)、AcMNPV-BmK IT(P10)和AcMNPV-BmK IT(PH)四种病毒感染Sf9细胞(病毒终浓度为3.8×1010vp/mL (1.5 MOI)), MTT实验结果表明,在感染细胞12 h和24h,病毒对Sf9细胞的抑制率由高到低依次为：AcMNPV-BmK IT(IE1)、 AcMNPV-BmK IT(P10)、AcMNPV-BmK IT(PH)和AcMNPV。感染36 h和48 h,病毒对Sf9细胞的抑制率由高到低依次为：AcMNPV-BmK IT(PH)、AcMNPV-BmK IT(P10)、AcMNPV-BmK IT(IE1)和AcMNPV。分别用以上四种病毒感染Sf9细胞12 h,48 h(病毒终浓度为0.56×1010vp/mL (0.2 MOI)), Western blot分析细胞c-Myc、cleaved-Caspase 3、Bax和Bcl-2的表达量变化,结果显示在感染12 h,AcMNPV-BmK IT(IE1)处理组c-Myc、cleaved-Caspase 3、Bax表达量要高于AcMNPV-BmK IT(P10)和AcMNPV-BmK IT(PH)处理组,而Bcl-2表达量则与之相反。在48 h, AcMNPV-BmK IT(P10)和AcMNPV-BmK IT(PH)处理组c-Myc、 cleaved-Caspase 3、Bax表达量要高于AcMNPV-BmK IT(IE1)处理组,而Bcl-2表达量则与之相反。第三部分实验利用野生病毒AcMNPV和重组病毒AcMNPV-BmK IT(P10)、 AcMNPV-vcath(PH)和AcMNPV-BmK IT(P10)-vcath(PH)四种病毒感染Sf9细胞(病毒终浓度为1.52× 1010vp/mL (0.6 MOI)、1.9× 1010vp/mL (0.8 MOI)、2.5× 1010 vp/mL(1 MOI)和3.8×1010vp/mL (1.5 MOI)),48 h后通过MTT法检测病毒对Sf9细胞增殖的抑制率,结果显示,AcMNPV-BmK IT(P10)-vcath(PH)处理组对Sf9细胞抑制率平均是重组单价病毒AcMNPV-BmK IT(P10)处理组的1.4倍,是AcMNPV-vcath(PH)处理组的2.1倍。分别用上述四种病毒感染Sf9细胞(病毒终浓度为0.56×1010vp/mL(0.2 MOI)),48 h后进行Western blot检测,发现与AcMNPV-BmK IT(P10)和AcMNPV-vcath(PH)处理组相比,AcMNPV-BmK IT(P10)-vcath(PH)处理组的Sf9细胞中c-Myc、cleaved-Caspase3、Bax蛋白表达量都有所增加,而Bcl-2蛋白表达量有所减少。本研究分析了由AcMNPV介导的BmK IT表达对Sf9细胞的影响及作用机制,研究结果可为重组病毒杀虫剂的研发及机制分析提供实验依据。