研究目的:含有TUDOR结构域的蛋白质（TDRD）主要负责识别甲基化的赖氨酸、精氨酸残基。“Reader”识别器蛋白对甲基化修饰的赖氨酸、精氨酸组蛋白的识别构成了复杂的基因表达调控网络,涉及多种生物过程,如多能性,分化和肿瘤发生。然而,人们对TDRDs调节异常对乳腺癌发展的认识知之甚少。PHF20L1和PHF20是经典的TDRD,它们拥有相似的结构域。据报道,PHF20识别组蛋白、非组蛋白的甲基化并涉及到细胞重编程过程,同时PHF20L1能够识别非组蛋白甲基化。然而,它在乳腺癌中识别组蛋白的作用并没有报道。几个研究小组已经证明PRC2和NuRD复合物可协同介导H3K27残基上甲基化和乙酰化的稳态,以调节胚胎干（ES）细胞中静默基因的表达。然而,PRC2和NuRD对H3K27位点的修饰的调节仍有待在癌症中进一步探索。因此,本研究旨在探讨以下三个问题。1.PHF20L1失调如何促进乳腺癌的发展;2.PHF20L1在乳腺癌中能否识别亦或如何识别组蛋白修饰;3.在乳腺癌中PRC2和NuRD复合物对H3K27位点修饰的调节。研究方法:1.通过在MDA-MB-231细胞中转染针对指定TDRDs的si RNA,然后进行细胞生长曲线和Ed U实验,以鉴定新的乳腺癌增殖调控因子。2.用组蛋白修饰肽阵来筛选PHF20L1的潜在结合位点,然后用组蛋白多肽pull-down实验验证筛选结果的,ITC滴定曲线和SPR实验分析以进一步验证PHF20L1 TUDOR结构域对H3K27me2的识别作用。3.稳定表达FLAG-PHF20L1的HEK293T细胞提取物使用抗FLAG珠子进行亲和纯化,并使用SDS-PAGE凝胶分离洗脱液,然后进行银染鉴定PHF20L1相互作用蛋白质。免疫沉共淀和GST/His pull-down实验以阐明PHF20L1、NuRD和PRC2之间分子间相互作用机制。最后用Gal4驱动的荧光素酶报告系统粗略测定PHF20L1的转录活性。4.在正常或敲低PHF20L1的MDA-MB-231细胞中用特异性的PHF20L1、EZH2、MTA1、H3K27me2、H3K27me3和H3K27ac抗体进行染色质免疫沉淀实验,和后续的深度测序（Ch IP-Seq）实验。深度数据分析结果显示PHF20L1与H3K27me2在整个基因组中有着明显的共定位现象,且这是PRC2和NuRD在PHF20L1占位基因区域富集所必需的。在正常和敲低PHF20L1的MDA-MB-231细胞中进行一系列的q Ch IP实验对Ch IP-Seq的结果进行了进一步的佐证。5.敲低PHF20L1并进行转录组RNA测序分析（RNA-Seq）来探究PHF20L1的转录靶标;通过进一步的基因集富集分析（GSEA）得到MYC信号通路和缺氧信号通路的基因集富集,然后进行q Ch IP实验以检测PHF20L1启动子上的MYC和HIF1a结合情况。接下来使用Seahorse XFe24系统（Seahorse Bioscience）测量由PHF20L1缺失或其他指定处理引起的糖酵解水平的变化情况。6.在缺失PHF20L1的MDA-MB-231细胞中进行碘化丙啶染色流式细胞仪细胞周期分析,克隆形成实验,以及transwell侵袭实验,来探索PHF20L1对乳腺癌细胞的细胞周期,增殖和转移的影响。在稳定转染对照、sh PHF20L1,EZH2、MTA1、sh PHF20L1+EZH2以及sh PHF20L1+MTA1的MDA-MB-231细胞中进行克隆形成实验和transwell实验以评估PHF20L1,MTA1和EZH2对乳腺癌细胞增殖和转移的协同作用。通过小鼠模型MDA-MB-231细胞乳腺原位接种成瘤以及尾静脉注射MDA-MB-231细胞的肺转移实验,以评估PHF20L1,MTA1和EZH2在体内对乳腺癌增殖和转移的影响。7.通过对收集的203份乳腺癌样本进行免疫组织化学染色分析PHF20L1,EZH2,MTA1和HIC1的表达谱,并进一步对两个公开的乳腺癌临床GEO数据库（GSE2034和GSE4922）的m RNA表达数据进行数据挖掘,以探究MYC/HIF1a-（PHF20L1-MTA1-EZH2）-FOXK2/HIC1轴在乳腺癌中的临床病理学相关性。使用网站（http://gepia.cancer-pku.cn/）来预测PHF20L1在多个癌中的基因表达谱来综合分析PHF20L1在不同癌症中的表达情况。8.使用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立Phf2011敲除小鼠,以探究PHF20L1在小鼠发育中的作用。通过携带floxed的Phf2011基因编辑小鼠与MMTV-Cre小鼠的配繁以产生Phf2011-/-乳腺条件性敲除（CKO）小鼠,其中Cre表达由小鼠乳腺肿瘤病毒启动子（MMTVcre）驱动,来研究Phf2011在乳腺发育中的功能。实验结果:1.基于RNAi筛选得到PHF20L1作为新的乳腺癌增殖调节因子。2.PHF20L1的TUDOR结构域是一种新型的H3K27me2识别模序。3.PHF20L1与PRC2和NuRD复合物一起协同发挥转录抑制作用。4.PRC2和NuRD在PHF20L1靶基因区域的占位需要基因组中PHF20L1和H3K27me2的共定位。5.作为MYC和HIF1a驱动的潜在致癌基因,PHF20L1与PRC2和NuRD复合物一起直接抑制一系列肿瘤抑制因子如FOXK2、HIC1等进而调节糖酵解过程。6.PHF20L1与其相互作用的转录抑制复合物协同作用,促进乳腺癌的发生发展。7.MYC/HIF1a-（PHF20L1-NuRD-MTA1）-FOXK2/HIC1轴在乳腺癌中具有密切的相关性,预示PHF20L1可作为乳腺癌的潜在治疗靶点。8.Phf20l1缺失诱导小鼠生长迟缓和乳腺导管发育延迟。实验结论:在本论文中,我们描述了含有TUDOR结构域的蛋白质PHF20L1作为新型H3K27me2阅读器蛋白,能够通过将多梳抑制复合物2（PRC2）,Mi-2/核小体重塑和脱乙酰酶（NuRD）复合物募集到特定染色质区域来发挥转录抑制活性,进而将PRC2介导的H3K27位点甲基化修饰和NuRD介导的H3K27脱乙酰化联系到了一起。此外,我们发现PHF20L1作为MYC和HIF1a驱动的潜在致癌基因,通过直接抑制肿瘤抑制因子如FOXK2和HIC1促进乳腺癌细胞的增殖、转移和糖酵解过程。PHF20L1高表达也与较高的乳腺癌组织学分级密切相关,并且在部分人类癌症中显着上调。Phf20l1敲除小鼠表现出严重的生长迟缓表型,并且Phf20l1的条件性缺失导致不适当的乳腺发育。我们的研究表明,PHF20L1是癌症治疗的一个具有光明前景的靶点,探索PHF20L1在乳腺癌中的功能将有助于提供更具建设性和有效的治疗策略。