哺乳动物的精卵结合与融合是一个多步骤并由精子和卵子表面的多种蛋白通过相互作用介导完成的过程。其中精子上的蛋白包括Izumo家族成员Izumo1-4、睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸激酶(TSSK)家族成员Tssk6以及蛋白二硫键异构酶(PDI)家族成员Pdia3(ERp57)等。但目前对于这些蛋白质在精卵结合和融合中的作用机制尚不明确。本实验克隆了绒山羊和绵羊Izumo4和Tssk6的cDNA序列,原核表达并制备了小鼠抗绒山羊Izumo4和Tssk6腹水多克隆抗体,研究了这两种蛋白在睾丸中的表达和在精子上的定位。使用免疫共沉淀和酵母双杂交技术鉴定了Izumo4和TSSK6与Izumo1及PDIA3之间的相互作用。首先根据GenBank中公布的哺乳动物Izumo4和Tssk6序列的保守区设计引物,成功地过克隆了绒山羊和绵羊Izumo4和Tssk6cDNA。克隆到的Izumo4和Tssk6cDNA序列与其它哺乳动物的直系同源基因高度同源,分别包含465bp和822bp的开放阅读框(ORF),编码154个氨基酸的Izumo4和273个氨基酸的TSSK6,均无跨膜区。把绒山羊Izumo4和Tssk6的编码区插入pET-32a原核表达载体,在大肠杆菌中成功地诱导表达出HIS-Izumo4和HIS-TSSK6融合蛋白。用纯化的融合蛋白免疫昆明(KM)小鼠,制备并纯化了小鼠抗绒山羊Izumo4和TSSK6腹水多克隆抗体,抗体能特异性识别睾丸组织和精子中的Izumo4和TSSK6蛋白质。用自制的抗体在绒山羊睾丸组织切片和顶体反应前后精子涂片进行了免疫化学检测,结果发现Izumo4广泛表达于睾丸组织中,定位于完整精子的顶体中,顶体反应之后消失。TSSK6主要在进入减数分裂之后的精母细胞和圆形精细胞中表达,定位于完整精子的顶体中,顶体反应之后消失。为了探讨蛋白激酶TSSK6与Izumo4以及精卵融合关键分子Izumo1和具有重要影响的PDIA3是否存在相互作用,本实验构建了带HA和HIS标签的真核载体pc-DNA-Izumo1(HA)、Izumo4(HA)、Izumo4(HIS)、Tssk6(HIS)及Pdia3(HA),分成四组分别共转染人293T细胞系,进行了免疫共沉淀实验。同时构建了酵母双杂交载体pGAD-Izumo1、Izumo4、Tssk6和pGBK-Tssk6、Pdia3同上分成四组,进行了酵母双杂交筛选实验。两个实验结果均提示Izumo1和TSSK6、Izumo4和TSSK6、Izumo4和PDIA3及TSSK6和PDIA3之间存在相互结合作用。