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棒头草（Polypogon fugax Nees ex Steud.）是禾本科棒头草属一年生草本植物,广泛分布于我国大部分地区,属于喜湿性杂草,在稻麦轮作模式下的小麦田发生尤为严重,可导致小麦减产甚至绝收。过去20年里,常用于小麦田防治棒头草等禾本科杂草的药剂是精噁唑禾草灵,其属于乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-Co A carboxylase,ACCase）抑制剂类除草剂,该类药剂作用靶标单一,在长期大量重复使用时极易促进杂草抗药性进化。本课题组前期在安徽省怀远县小麦田采集到棒头草疑似抗性种群AHHY,初步研究发现,靶标基因ACCase第1999位氨基酸突变（Trp-1999-Ser）和细胞色素P450s（Cytochrome P450s,P450s）解毒酶活性增强同时参与了AHHY对精噁唑禾草灵的抗性,但是具体哪些P450基因参与了抗性还不清楚。本研究基于课题组前期建立的棒头草三代全长转录组基因资源,通过基因功能注释、序列BLAST比对、基因表达分析,详细鉴定了棒头草在不同实验条件下稳定表达的内参基因集,以用于精确的实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,RT-q PCR）分析,并系统比较了全长转录组中所有注释为P450的基因在棒头草敏感和抗性种群中的时间表达特性,进而明确了在抗性生物型中上调表达且/或受除草剂诱导表达的基因,为解析P450s介导的代谢抗性机制奠定了基础。主要研究结果如下:1.棒头草内参基因（集）鉴定选择7个在其它植物物种中稳定表达的内参基因作为候选基因,包括肌动蛋白（Actin,ACT）、真核翻译起始因子4A（Eukaryotic initiation factor 4A,EIF4A）、延伸因子1α（Elongation factor 1α,EF1α）、18S核糖体RNA（18S r RNA,18S）、25S核糖体RNA（25S r RNA,25S）、1,5-二磷酸核酮糖（Ribulose-1,5-bisphosphate,RUBP）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）。基于棒头草全长转录组测序数据,通过基因功能注释结合NCBI同源序列BLAST比对,获得棒头草ACT、EIF4A、EF1α、18S、25S、RUBP、GAPDH序列。以棒头草敏感（Susceptible,S）种群SDTS和抗性（Resistant,R）种群AHHY为材料,对7个候选内参基因进行扩增特异性和表达稳定性分析,以明确在不同除草剂胁迫下、在不同生长阶段或者在不同组织器官中稳定表达的内参基因（集）,以用于精确的RT-q PCR分析。结果表明:在精噁唑禾草灵胁迫下,稳定表达的内参基因集是ACT、18S和RUBP;在甲基二磺隆胁迫下,稳定表达的内参基因集是GAPDH和EF1α;在棒头草不同的生长阶段中,稳定表达的内参基因集为ACT、EF1α、EIF4A和25S。然而,在棒头草不同组织器官中未鉴定到稳定表达的内参基因（集）。2.棒头草全P450s分离与表达分析基于棒头草全长转录组基因资源,通过基因功能注释共分离到169个假定的P450基因,根据序列相似性BLAST比对,确定了48个潜在的P450基因。针对不同基因保守区序列设计特异性引物,选用在精噁唑禾草灵胁迫下稳定表达的内参基因集ACT、18S和RUBP进行精确的RT-q PCR分析。为了筛选与棒头草对精噁唑禾草灵代谢抗性相关的P450s,以棒头草S种群SDTS和R种群AHHY为材料,分析了不同P450s在精噁唑禾草灵处理后不同时间点的表达模式,结果表明:在R种群中,22个P450基因在除草剂处理后的至少一个时间点上调表达了3倍以上,其中CYP709B1、CYP71A1-4、CYP711A1、CYP78A9、P450-11和P450-39等6个基因被除草剂处理诱导上调表达了10倍以上;在S种群中,有40个P450基因在除草剂处理后的至少一个时间点上调表达了3倍以上,其中18个基因上调表达了10倍以上。之后比较了在精噁唑禾草灵处理前后不同时间点,不同P450基因在R和S种群中的表达差异,结果表明:相对于S种群,CYPRO4、CYP313a4、CYP57、CYP37、P450-13等24个基因在R种群中药剂处理前后至少一个时间点表达量上调且上调差异表达3倍以上,其中CYP57、P450-13、CYP97B2、CYP94B3-1、CYP71D8、CYP71A1-5、P450-39和CYP92A44-2等8个基因呈现组成型上调;在药剂处理后6～24 h,CYPRO4、CYP313A4和CYP51H11等3个基因在R种群中持续上调表达。综合上述结果,CYP709B1、CYP71A1-4、CYP711A1、CYP78A9、CYPRO4、CYP313A4、CYP51H11、P450-11、P450-39等9个基因在R vs S植株中呈现组成型和/或诱导型上调表达,这与抗性种群增强的P450s活性一致,可以作为棒头草解毒精噁唑禾草灵的关键候选基因。综上所述,本研究明确了棒头草在不同实验条件下的稳定表达内参基因集,为目标基因在该物种中的精确定量分析奠定了基础;同时详细表征了棒头草全P450s在除草剂胁迫下的时间表达模式和在抗性vs敏感种群中的表达差异,并明确了在抗性生物型中高表达且/或受除草剂诱导表达的基因,为进一步解析P450s介导的代谢抗性奠定了基础,同时为解析其它禾本科杂草的代谢抗性机制提供一定参考。