农药污染是当今我国环境污染中面临的一个重大问题。由于我国农药的生产和使用量大,分散型农业种植较多,农药不规范使用和过度滥用等现象加重了农药对农业环境的面源污染,加上近年来出现的农药生产和加工企业搬迁,其遗留的场地中存在着大量的制造农药及合成中间有机化合物,造成了土壤中多种不同农药复合污染的现状,而目前国内外还缺少有效解决当前复合农药污染的修复措施。利用生物修复手段,从土壤中筛选出对复合农药具有广谱农药降解特性的微生物可作为消除土壤复合农药残留的有效措施。本文通过定向驯化和筛选广谱农药降解微生物,并研究单种及复合农药的降解特性和降解机理,通过综合分析农药在土壤中的残留变化以及土壤微生物种群变化,得出广谱农药降解菌对农药污染土壤的修复特性。具体实验结果如下:1、广谱农药降解微生物的筛选和鉴定。以有机磷农药敌百虫为初始筛选农药,选用长期受到农药污染的土样和水样样品,经敌百虫为碳源的定向驯化,共筛选出可同时利用敌百虫农药为生长碳源、磷源和碳磷源的降解细菌PA F-3和真菌PA F-2,同时两株微生物均可在以15种不同农药为碳源的固体无机盐培养基上生长;经鉴定两株微生物分别属于芽孢杆菌属的Bacillus tequilensis和曲霉属的Aspergillus sydowii。2、研究了敌百虫农药的微生物降解特性。细菌PAF-3和真菌PA F-2的敌百虫降解效率受到多种环境因素影响,分别使用响应曲面模型预测得到PA F-3降解敌百虫的最适条件为:恒温培养温度28℃,敌百虫初始浓度125mg/L,细菌PA F-3的接种量为4%(v/v),在此条件下的敌百虫降解率为88.7%;真菌PA F-2的敌百虫最适降解条件为:温度28℃,敌百虫初始浓度50 mg/L,pH值为6.5,预测最大值降解率为75.3%;添加酵母提取物可显著性增加细菌和真菌对敌百虫的降解率,培养5天后降解率分别达到98.0%和100.0%,经降解动力模型分析,该培养条件下100 mg/L敌百虫的半数降解时间(DT50)分别缩短至1.82天和0.9天。3、研究了敌百虫农药的微生物降解机理。利用GC-MS检测敌百虫降解中间产物,首次得到敌百虫的微生物降解途径。结果表明敌百虫的真菌和细菌降解机理相似,通过水解反应导致敌百虫分子内的C-P键断裂,从而产生甲基膦酸二甲酯和水合氯醛分子,并进一步降解为微生物可利用的磷酸盐和葡糖苷酸,从而促进微生物的生长;真菌PA F-2还可进一步降解敌百虫的水解产物敌敌畏,断裂敌敌畏分子的碳碳双键形成三甲基正磷酸盐和二氯甲烷,最终形成磷酸化合物;在以敌百虫为惟一磷源的培养条件下,真菌PA F-2还可降解敌百虫和敌敌畏分子产生新的中间降解产物三甲基磷酰基乙酸酯、乙基磷酸二甲酯和二氯乙酸甲酯,也可进一步降解转化成亚磷酸二甲酯和葡糖苷酸。4、研究了广谱农药降解细菌PA F-3的复合农药降解特性和机理。经固体平板检测,细菌PA F-3的广谱农药降解能力相对真菌PA F-2较强;经复合农药的逐步驯化,细菌PA F-3在含有4种氯酚农药的MSM液体培养基中培养14天,对邻氯苯酚和2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)的降解率最高值分别达到48.5%和61.5%,而对2,4-二氯苯氧羧酸(2,4-D)和4-甲基-2-氯苯氧羧酸(MCPA)的降解率较低;细菌PA F-3在含有5种复合农药的MSM培养基中培养41天内,对2,4-DCP、敌百虫、高效氯氰菊酯(β-CP)、2,4-D以及乙草胺的最高降解率分别达到100%、100%、96.1%、69.5%和71.4%;通过综合分析GC-MS检测的复合农药降解中间产物,结果表明PA F-3降解含有氯原子的苯环类有机物时,主要发生脱氯反应和氧化反应,形成苯酚,再通过氧化反应发生羟基邻位的双键断裂,导致苯环断裂形成生物可利用的醇类或者酸类化合物;对乙草胺的降解途径主要通过脱乙氧甲基和断裂酰胺基,形成6-乙基-2-甲基苯胺,再以脱氮作用形成苯酚类苯环化合物并进一步降解;PA F-3对β-CP的降解作用主要为水解反应,其中生成的3-苯氧基苯甲醛是微生物降解β-CP的重要中间产物,再经过脱氯、氧化和苯环断裂等作用达到对β-CP的生物降解。5、研究了 PA F-3对敌百虫污染土壤的修复作用。农药污染土壤中添加广谱降解菌PA F-3显著提高土壤中敌百虫的降解速率,培养6天左右即完全降解50 mg/kg敌百虫;通过DGGE群落结构以及特征条带扩增测序分析,添加敌百虫土壤中变形菌门(Proteobacteria)的种群丰度出现先升高再随培养时间延长降低的趋势,放线菌门(Actinobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)变化不显著,而在土壤加入PA F-3后,厚壁菌门(Firmicutes)的芽孢杆菌属(Bacillus)随培养时间逐渐增加,而原土壤中的优势菌群放线菌门没有在特征条带中检测出,结果表明添加芽孢杆菌属的降解细菌PA F-3,土壤优势种群向着降解菌的种群发展,而原本处于优势的细菌群落,相对丰度显著降低或者消失;加入降解菌PA F-3,可减少土壤敌百虫农药对真菌群落丰度的影响。6、研究了 PA F-3对复合农药污染土壤的修复作用。添加细菌PA F-3在培养41天内可完全降解复合农药污染土壤中的2,4-DCP、敌百虫以及β-CP,对2,4-D以及乙草胺的最高降解率分别达到91.6%和90.3%,显著提高了土壤中5种复合农药的平均降解速率、半数降解时间和降解常数;DGGE结果表明,加入5种农药的土壤中优势菌群为变形菌门的a-、β-和γ-变形菌纲,而同时添加5种农药和降解细菌PA F-3后,土壤优势种群向着降解菌的种群(厚壁菌门)发展,而原本处于优势的变形菌门,种群浓度显著降低;真菌优势菌群在加入降解细菌后变为子囊菌门和担子菌门,缓解了加入复合农药对土壤真菌群落结构的影响。