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核点蛋白SP100(Nuclear dot-associated SP100 protein)是构成早幼粒白血病核小体相关蛋白(Promyelocytic leukaemia nuclear bodies,PML-NBs)的组成性结构,在稳定PML-NBs结构、抗病毒、转录调控和细胞凋亡等生命活动中发挥重要作用。人、鼠上的研究表明,SP100基因存在着复杂的变异剪接方式。目前,尚未见有关猪SP100的研究报告。本研究利用分子生物学技术克隆猪SP100基因cDNA序列及其变异剪接体、分析其亚细胞定位情况,并利用Minigene技术深入分析其变异剪接情况,得到的主要研究结果如下:(1)首次克隆猪SP100基因并获得7个变异剪接体(Gen Bank accession Nos.KC538899、KC540633-5、KF017543-4、KP735962)。V1扩增序列全长1498 bp,含有66 bp 5’非翻译区(Untranslated region,UTR)、1161 bp CDS区和271 bp 3’-UTR,预期编码386 aa。V2、3、5-7是V1发生外显子跳跃形成的,V4是V1发生外显子重复形成的;在相应的多肽链上,V3、4、6和7发生了内部缺失,V2和5则发生移码突变,导致翻译提前终止。V2-7多肽链长度依次为66、336、442、144、272、308 aa。(2)亚细胞定位分析表明,V1、V3、V4、V6和V7都定位在细胞核内,V2和V5均匀地分布在整个细胞内,表明移码突变导致V2和V5的核定位序列(Nuclear localization sequence,NLS)丢失;对变异剪接体V1的截短突变体进行亚细胞定位分析,发现V1(221-386aa)、V1(301-386 aa)定位于细胞核中,V1(1-138 aa)、V1(344-386 aa)在细胞核和细胞质中都有;结合V1、V3、V4、V6和V7的序列组成情况,我们确定NLS位于V1的301-343 aa处;在生物信息学分析的基础上,对334位碱性氨酸(精氨酸)进行定点突变,确定了改变氨基酸的极性对V1亚细胞定位的影响,发现当变为中性氨基酸(色氨酸)时,V1仍定位于细胞核内,当变为酸性氨基酸(谷氨酸)时,则位于细胞质内。(3)序列分析发现,外显子2、8和9含有变异剪接位点,为可变剪接外显子,针对这一区域构建了Minigene载体;通过Minigene分析,在该区域内寻找到3种新的变异剪接方式(NV1-3);为了对Minigene的分析结果进行体内验证,设计了特异扩增NV2的引物,利用RT-PCR方法对内源转录的SP100基因进行扩增,成功获得了以NV2方式剪接的新变异剪接体(命名为V8),证明了Minigene技术可以用于分析基因在体内的变异剪接情况。(4)变异剪接体V8是V1发生外显子3-8跳跃形成的,扩增片段长822 bp,含有66 bp5’UTR、198 bp CDS区和558 bp 3’-UTR。外显子3-8缺失导致终止密码子提前出现,预期编码65 aa的多肽链。该序列已经提交到Gen Bank(accession No.KP939097)。