论文部分内容阅读
L-色氨酸（L-tryptophan,L-trp）,作为人体8种必需氨基酸中第二大必需氨基酸,是多种重要生物活性物质的前体,广泛应用于药品、食品以及饲料等多种行业。随着L-色氨酸国内外需求量的不断增加,使其成为重要的研究热点。微生物发酵法因其原料易得、廉价、终产物纯度高、易于提取和绿色环保等优点已被广泛应用于L-色氨酸的生产。其中,大肠杆菌作为应用广泛的模式菌株,因其遗传背景清晰、遗传改造简单、繁殖较快及容易培养等优势,已被广泛应用于工业化商品的代谢工程改造中。在菌株改造方面,理性改造和非理性筛选都具有一定的优势,但同时也存在一些局限性。因此,本研究在传统化学诱变基础上,结合理性设计对L-色氨酸菌株进行构建。首先,以大肠杆菌野生型MG1655为出发菌株构建L-色氨酸生产底盘细胞。其次,通过等离子体诱变（ARTP）技术获得L-色氨酸高产菌株,通过全基因组测序对其遗传背景进行机理解析。最后,通过转录组学结合代谢工程手段指导理性改造设计。主要研究内容及结果如下:（1）以大肠杆菌野生型MG1655为出发菌株,通过敲除基因组上色氨酸吲哚裂解酶基因tna A,过表达3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶基因aro Gfbr与色氨酸操纵子trp EfbrDCBA构建底盘细胞TD0,其摇瓶发酵L-色氨酸产量达到0.3 g/L。（2）构建L-色氨酸生物传感器p Trp-GFP,对ARTP诱变后的菌株进行高通量筛选,筛选得到一株L-色氨酸高产菌株TD,其产量在摇瓶发酵中达到了1.4 g/L。（3）提取菌株TD基因组,进行全基因组测序,并与大肠杆菌野生型MG1655基因组进行比较,确定其突变基因位点及类型。通过对部分突变基因进行回复突变,分析L-色氨酸高产机制,为TD菌株的理性改造提供依据。同时对菌株TD与TD-rpo S（rpo S基因回复突变菌株）进行转录组学分析,进一步对TD菌株的理性改造提供理论依据。（4）基于基因组学与转录组学数据,结合TD菌株以及回复突变菌株的发酵结果,从L-色氨酸分支途径、分支酸合成途径与磷酸戊糖途径三个模块对TD菌株进行一系列改造。最后得到L-色氨酸产量极显著提高的菌株TD020,其产量达到4.2 g/L,转化率为9.01%。