杜泊绵羊作为高品质肉羊却由于冷冻精液受精率低,严重制约了绵羊精液在生产中的普及和应用。而目前,对精子冷冻损伤的研究和评估主要集中在商业化冷冻保护剂的研究方面,而对精子冻伤机制的研究相对缺乏。精子冻融过程会使一些精子蛋白质损伤和缺失,而这些蛋白质的改变对精子功能有质的影响,二维电泳和质谱等蛋白质组学技术的发展为从蛋白质层面全面揭示精子冻伤机制提供了技术支持。为此,本实验以新鲜精液为对照组,对绵羊冷冻后精子蛋白变化开展深入研究。结果显示:1、冻精组与鲜精组相比活力,顶体完整率,透明质酸酶反应率均显著降低。2、运用双向电泳技术,研究冷冻前后绵羊精子总蛋白变化情况,并利用PDQuest图像软件分析冷冻解冻后精子、鲜精总蛋白双向电泳图,共检测出165个蛋白点,将表达差异倍数设定为2倍,共检测到75个差异点,其中上调蛋白点48个,下调蛋白点27个。3、应用蛋白质相对定量分析技术,研究冻解冻后精子、鲜精蛋白质差异性及差异蛋白的可能功能。结果表明,对DIA质谱结果以丰度比≥1.5或者≤0.67,且P_value≤0.05作为筛选条件对鲜精组和冻精组两组样本进行差异蛋白质筛选,共筛选出151个差异蛋白,其中上调蛋白58个,下调蛋白93个。利用GO分析对鉴定到的差异蛋白进行分析,表明冷冻对精子造成的蛋白变化主要是与精子应激反应相关。4、对质谱结果以双向范围分子量15-300kDa,PH3-10,表达差异倍数为2进行差异蛋白的筛选,共筛选出78个差异蛋白,上调蛋白32个,下调蛋白46个。与双向电泳研究方法确定蛋白变化数量相比,检测出的差异蛋白总数无显著差异,蛋白质组学定量分析75个,双向电泳78个;蛋白质组学定量分析检测上调蛋白个数32个,双向电泳48个,不一致;下调蛋白个数,蛋白质组学定量分析46个,双向电泳27个,也存在差异。结论:绵羊精子冷冻前后蛋白表达会发生明显变化。特别是与应急有关的蛋白变化明显。