抗体对于蛋白质研究至关重要,因为它们可以与蛋白特异性结合,从而使研究人员能够在体外或体内对蛋白质进行鉴定和功能研究。随着蛋白质组学的迅猛发展,迫切需要大量的抗体来满足高通量的蛋白质组学研究的需求。传统抗体制备方法需要全蛋白抗原或合成肽免疫动物,全蛋白不易得到,纯化过程耗时、费力,而通过化学合成法合成抗原肽成本较高,并且还需要与载体蛋白偶联后才能用于动物免疫,因此,对于高通量的抗体制备而言,抗原的获得是其中关键的限速步骤。抗原表位是诱导特异性免疫应答的最基本的结构和功能单位,因此,本研究将目光投向表位抗原,目的就是建立一种基于B细胞表位的蛋白质抗体制备新方法,实现在不需要制备完整蛋白质抗原条件下的抗体制备。本研究的基本策略就是根据蛋白质的一、二级结构和空间结构信息,选择蛋白质抗原的特异性B细胞表位,将该B细胞表位序列展示于T7噬菌体的表面,提取重组的T7噬菌体免疫动物,通过细胞融合技术制备单克隆抗体,通过ELISA、Western blot等方法筛选能够识别全蛋白质抗原的抗体。如何选择有效的B细胞表位是能否实现无完整蛋白质抗原条件下抗体制备的关键。对于B细胞表位的选择,我们提出了以下的策略:对于已有空间结构信息的蛋白质抗原,直接选择蛋白分子表面的loop区或无规卷曲区域的小肽序列作为候选B细胞表位;对于缺乏空间结构信息的蛋白质抗原,需要根据蛋白质抗原的特点具体分析。若蛋白质抗原C末端的序列亲水性好,可以选择C末端的6～10个氨基酸的序列作为候选B细胞表位,并且最好该序列为该蛋白质所特有;也可采用B细胞表位预测程序进行分析,选择不同程序预测的共有B细胞表位;对于同源性很高的家族蛋白,根据序列比对结果选择差异较大的区域,并且所选序列应该符合B细胞表位的特征。基于以上原则,本实验选择了10个蛋白的14个表位,并对其中的12个表位进行了验证。由于蛋白质抗原的B细胞表位肽分子量小,直接用作免疫原免疫动物很容易被细胞内的蛋白酶降解,因此,需要与合适的载体偶联以增强其免疫原性。本课题中采用T7Select415-1b高拷贝噬菌体载体展示B细胞表位,该载体能够在T7噬菌体表面同时展示415个小肽拷贝,所展示小肽的长度可达到50个氨基酸。我们用T7Select415-1b分别展示了来源于10个蛋白质的12个长度为6个、9个或11个氨基酸的表位。用提取的重组噬菌体免疫动物,六周后经ELISA检测,各种重组噬菌体都能诱导针对相应B细胞表位的抗体产生,且特异性良好。用Western blot检测了其中的4种抗血清,无论是针对蛋白质C末端小肽的抗体,还是针对蛋白表面loop区的抗体,均能识别相应B细胞表位来源的全蛋白分子。由此可见,T7噬菌体-表位肽抗原具有较好的免疫原性,是比较理想的表位抗原,完全可以替代常用的匙孔蓝蛋白和牛血清白蛋白等小肽偶联载体蛋白。本课题还尝试多表位抗原混合免疫策略。将来源于五种蛋白质抗原的五种不同的表位抗原混合免疫同一只兔子,八周后采用ELISA检测发现,兔子同时产生了针对五种不同表位的抗体,但效价存在差别。随着免疫次数的增加,仅有一种针对MAGE A10表位的抗体效价仍保持较高水平,针对其它表位的抗体效价均大幅降低,这表明多表位混合免疫可能存在优势表位问题,利用混合免疫法同时制备针对多表位的抗体,需把握好免疫次数和取血的时间点,才能获得理想的抗血清。为了将针对某一表位的抗体从多种抗体的混合物中分离出来,制备了针对其中两个表位的亲和柱,让多种抗体的混合物依次串联通过亲和柱,之后,逐一洗脱,得到了两种特异性良好的多克隆抗体,为批量化制备单特异性多克隆抗体奠定了基础。为了进一步验证基于B细胞表位的替代抗原策略制备蛋白质抗体的可行性,本课题还利用该策略制备了针对三种蛋白质抗原的特异性单克隆抗体。从HPO、Pif1α和Pif1β三种蛋白质抗原中各选取了一个B细胞表位,制备了T7噬菌体-表位肽抗原,通过动物免疫、细胞融合和筛选,最终得到了三株单克隆抗体,它们分别能够特异性识别相应的B细胞表位。针对Pif1βB细胞表位的单克隆抗体由于没有全蛋白抗原,没有验证其是否能够识别Pif1β全蛋白。但针对HPO和Pif1α的B细胞表位的单克隆抗体经Western blot验证,分别能够识别HPO和Pif1α全蛋白抗原,并且针对Pif1α的单克隆抗体还可用于Pif1α在细胞中的亚细胞定位,其定位结果与文献报道的Pif1α的核定位一致。这些实验结果充分说明,基于B胞表位的蛋白质抗体制备技术是完全可行的。总之,通过本课题的研究建立了基于B细胞表位的蛋白质抗体制备方法,实现了无需完整抗原的蛋白质抗体的制备。该技术方法可以实现基于B细胞表位的替代抗原的快速制备,可满足蛋白质组学研究中高通量抗体制备对抗原的大量需求。基于B细胞表位的蛋白质抗体制备方法还可用于制备特定功能的抗体,如中和性抗体、抑制性或激动性抗体,这对于开发具有治疗作用的抗体和疫苗具有重要意义。