论文部分内容阅读
随着年龄增加,衰老机体的器官、组织和细胞将逐步地发生不可逆转的、全面的结构和功能衰退,自然衰老本身并不是疾病,但它与许多老年性疾病紧密相联。在脑衰老进程中,由于脑结构和功能的进行性衰退,最终将导致多种神经退行性疾病发生。神经退行性疾病是由多种原因所致的慢性进行性神经元退行变性、丢失及死亡所致病人行为异常和功能障碍的神经性系统疾病。现代研究发现,脑区特定部位如海马齿状回等存在神经干细胞(Neural stem cells,NSCs),通过其增殖与分化维持与控制神经系统结构与功能的稳态。衰老机体的应激与损伤状态时保持与恢复稳态能力下降,这些现象与组织中干细胞数量减少和功能衰退密切相关。目前认为,神经退行性疾病发生与发展与神经干细胞衰老密切相关。随着人口老年化进程加快,神经退行性疾病发病日趋严峻,已成为严重危害人类健康的重大疾病。遗憾的是迄今还没有找到有效防止神经退行性疾病途径。人参是中医临床的“补气”要药,人参皂苷是人参的主要药物活性成分,它具有多方面的药理作用,已广泛应用于临床多种疾病的治疗或辅助治疗。近年研究认为,人参皂苷Rg1是人参皂苷中重要的单体成分,具有明确的延缓衰老作用,但其作用机制尚未清楚,值得深入研究。本课题组前期研究证明,1.人参皂苷Rg1能拮抗致衰剂D-半乳糖所致大鼠大脑衰老,明确改善脑衰老大鼠行为学,促进SVZ区NSCs的神经发生;2.体外实验也证明Rg1的确能延缓NSCs衰老,提高衰老NSCs增殖和分化能力。但人参皂苷Rg1延缓脑衰老与调控NSCs衰老的相互关系及其机制尚不明确。迄今,还未见从神经干细胞角度探讨人参延缓脑衰老机理的报道。本研究建立Nestin-GFP转基因小鼠衰老模型及NSCs体外衰老模型,利用iTRAQ及生物信息学技术,分析Rg1对衰老神经干细胞蛋白质组的影响,深入阐释人参皂苷Rg1延缓脑衰老及调控NSCs衰老相关机制。为人参皂苷Rg1用于防治神经系统老年性疾病提供新思路。1材料和方法1.1将6-8周龄C57BL/6 Nestin-GFP转基因小鼠随机分为四组,每组10只。衰老组(D-gal组):小鼠颈背部皮下注射D-gal(120 mg/kg/d)共42d;Rg1拮抗衰老组(Rg1+D-gal组):注射D-gal剂量与时间按照衰老组方案执行,第16d起,开始腹腔注射人参皂苷Rg1(40 mg/kg/d),共26d;正常Rg1组(Rg1组):小鼠皮下注射等量生理盐水共42d,第16d起,腹腔注射人参皂苷Rg1(40 mg/kg/d)共26d;正常对照组(control组):注射等时与等量生理盐水。模型建立后,第2d进行以下指标检测:1)Morris水迷宫评估各组小鼠的空间学习记忆能力;2)免疫荧光检测各组小鼠海马组织NSCs的数量;3)衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测各组小鼠海马组织细胞衰老水平;4)检测各组小鼠海马组织氧化与抗氧化相关指标及炎症因子的变化;5)各组小鼠海马组织细胞中相关衰老信号通路的变化。1.2从Nestin-GFP转基因C57BL/6小鼠海马组织中分离提取NSCs,进行原代与传代培养,将第3代(P3代)NSCs分为4组。对照组(control):在NSCs完全培养基中培养;正常Rg1组:在对照组基础上加入Rg1(终浓度为20μg/ml)培养;D-gal组:在对照组基础上加入D-gal(终浓度为10mg/ml)培养;Rg1+D-gal组:在D-gal组基础上加入Rg1(终浓度为20μg/ml),各组均培养48h。进行以下指标检测:1)CCK-8检测各组NSCs增殖能力;2)衰老相关b-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测各组NSCs衰老水平;3)流式细胞术检测各组NSCs中活性氧水平及抗氧化酶活性。4)Western blot检测各组NSCs中衰老相关Akt/mTOR信号通路的变化;5)利用iTRAQ及生物信息学技术检测体外D-gal组和Rg1+D-gal组NSCs蛋白质组的变化。2结果2.1体内结果1)Morris水迷宫实验结果显示,D-gal注射致衰老小鼠空间记忆能力明显降低,而Rg1拮抗D-gal注射后,小鼠空间记忆能力明显改善;2)免疫荧光观察结果显示,D-gal组小鼠NSCs标志物的Nestin和SOX-2阳性细胞数明显降低,而Rg1拮抗D-gal注射后,NSCs标志物Nestin和SOX-2阳性细胞数显著降低得到抑制;3)SA-β-Gal染色结果显示,D-gal注射致衰老小鼠海马组织细胞衰老水平显著升高,而Rg1拮抗D-gal注射后,小鼠海马组织细胞衰老水平有所降低。4)D-gal注射致衰老小鼠海马组织MDA的水平明显升高,SOD和GSH-px的活性显著降低,炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平显著增高。而Rg1拮抗D-gal注射后,MDA水平降低,SOD和GSH-px活性增高,IL-1β、IL-6和TNF-α的水平降低。5)D-gal注射致衰老小鼠海马组织中p19和p21mRNA水平增高,p53和Rb蛋白水平增高,而p-Rb的水平降低;磷酸化IκB(p-IκB)、NF-κB以及IP-10的水平明显增高。而Rg1拮抗D-gal注射后,p19和p21mRNA水平以及p53和Rb蛋白水平降低,p-Rb的水平升高;磷酸化IκB(p-IκB)、NF-κB以及IP-10的水平降低。2.2体外结果1)人参皂苷Rg1能够提高衰老NSCs的增殖能力,并且在20μg/ml及以下浓度时,NSCs的增殖能力与Rg1的浓度呈正比关系。2)D-gal组SA-β-Gal染色阳性神经球百分比明显增高,而Rg1+D-gal组SA-β-Gal染色阳性神经球百分比显著降低。3)D-gal组NSCs中ROS的水平明显升高,而Rg1+D-gal组NSCs中ROS水平明显降低。Rg1能够提高细胞内SOD和GSH-px两类抗氧化酶的活性。4)人参皂苷Rg1能够下调AKT/mTOR信号通路。5)D-gal组和Rg1+D-gal组NSCs蛋白质组生物信息学分析结果显示:部分酶活性相关的蛋白表达发生变化,如氧化还原酶活性、羟基甲基戊二酰-Co A还原酶激酶活性以及乙酰辅酶A激酶活性相关蛋白。提示调控细胞衰老的重要通路mTOR信号通路在Rg1处理后被抑制。此外我们还发现自噬调控相关信号通路发生了变化。3结论3.1 Rg1能够拮抗D-gal,延缓小鼠脑衰老;3.2 Rg1拮抗D-gal延缓脑衰老机制可能与降低海马组织氧化应激,下调衰老相关信号通路有关;3.3 Rg1能拮抗D-gal,调控NSCs衰老,也可以提高衰老NSCs增殖能力,其机制可能与下调衰老相关AKT/mTOR信号通路有关;3.4 Rg1调控衰老NSCs中与氧化还原酶活性、羟基甲基戊二酰-Co A还原酶激酶活性以及乙酰辅酶A激酶活性相关蛋白的表达变化以及mTOR信号通路和自噬调控相关信号通路的改变。