第一部分:小鼠骨髓来源的内皮祖细胞的分离、培养、鉴定目的:体外培养诱导小鼠骨髓单核细胞分化,建立小鼠内皮祖细胞(EPC)的培养体系,为后续的研究做准备,也是下一步工作的前提。方法:选用4周龄小鼠,消毒后取其股骨,胫骨,冲洗骨髓,得到骨髓悬液。后加入小鼠淋巴细胞分离液,在水平离心机下分离,得到单核细胞层,将此层吸出离心洗涤后在改良EGM-2MVSingleQuots培养液中重悬,再接种到事先用纤维连接蛋白包被的培养板上。培养至第2天,半量更换培养液,培养至第4天,全量更换培养液,之后每隔一天更换一次培养液,培养至第14天。我们用Dil标记的低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)的摄取能力,FITC标记的荆豆凝集素(FITC-UEA-1)的结合能力和细胞表面标记的流式细胞检测来鉴定EPC。结果:骨髓单核细胞取出后,接种至培养板,可见密集的小圆形细胞,随着培养时间增加,细胞逐渐变大变梭形,培养至第7天,可见细胞呈梭形,并且形成集落,即早期EPC。培养至第14天,可见细胞呈铺路石样外观,即晚期EPC。细胞鉴定实验提示几乎所有细胞均显示红色荧光和绿色荧光。细胞表面标记的流式细胞检测显示CD34,和Flk-1双阳性细胞的比率为84.85%。结论:根据细胞在培养第7天呈现梭形细胞集落形态,在培养第14天呈现铺路石样形态,摄取及结合功能阳性,细胞表面标记流式细胞检测双阳性等结果,提示培养细胞为EPC。第二部分:脂多糖在体外体内环境下对小鼠内皮祖细胞功能的影响目的:前期研究显示脂多糖(LPS)是造成急性肺损伤(ALI)的一个致病因素,并且发现内皮祖细胞(EPC)参与了损伤肺组织的修复,我们猜想LPS是否直接影响EPC的数量和功能,其对EPC的损伤是否是其造成ALI的一个方面。方法:在体外实验中,用培养液将LPS稀释至10 pg/ml,100 pg/ml,1 ng/ml,10 ng/ml and 100 ng/ml,然后加入培养至第7天被称为早期EPC的培养板中,分别培养4 h,8 h,12 h和24 h,然后检测EPC的增殖,衰老和黏附功能。另一方面,在体内实验中,采用气管内滴注LPS(2.5mg/kg)建立小鼠ALI模型,4h,8h,12h和24 h之后,我们将小鼠骨髓取出,培养至第7天,得到早期EPC,检测EPC的增殖,衰老和黏附的功能。结果:在体外实验中,在100 ng/ml浓度的LPS的孵育下,EPC的衰老能力和黏附能力呈现下降,而增殖能力呈现升高。在体内实验中,EPC的增殖能力在LPS气管内滴注后8 h和12h降低,衰老能力在12 h和24h降低,而黏附能力在8h升高,在12 h和24 h降低。结论:LPS对于EPC的影响在体内和体外有所不同。在体外实验中,100 ng/ml的LPS对于EPC是敏感的。在LPS诱导的ALI的过程中,EPC的活性在LPS感染后8h至12 h达到高峰,随后下降。第三部分:内皮祖细胞移植联合辛伐他汀对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的修复作用目的:前期研究证实内皮祖细胞(EPC)参与急性肺损伤(ALI)的修复,许多研究也提示他汀类药物在体内环境和体外环境均能提高EPC的功能。因此,本实验探索辛伐他汀是否能够通过提高EPC的活性来参与脂多糖(LPS)诱导的ALI的修复。并且评估内皮祖细胞移植联合辛伐他汀是否能够更进一步地修复LPS诱导的ALI。方法:BALB/C小鼠事先腹腔注射辛伐他汀(20mg/kg),24h之后再次给予腹腔注射,并且行LPS气管内滴注,2h后给予尾静脉移植EPC,LPS气管内滴注后48 h,检测毛细血管通透性,内皮修复情况及炎性因子表达情况。结果:研究结果显示EPC移植和辛伐他汀均能缓解LPS诱导的小鼠ALI,两者联合治疗可部分地提高治疗效果。结论:EPC移植和辛伐他汀均能缓解LPS诱导的小鼠ALI,这种效应可被它们联合治疗所进一步加强。辛伐他汀对EPC的作用可能是他汀类药物多效性中的一种。虽然其中的机制尚不清楚,但是EPC移植联合辛伐他汀可能是潜在的一种基于细胞的,炎症介导的治疗ALI/ARDS的方式。