捻转血矛线虫是一种高致病性寄生虫，可感染绵羊，山羊和牛等反刍动物，呈世界性分布，严重影响畜牧业的发展。捻转血矛线虫病（Haemonchosis）是由圆线目（Strongylida），毛圆科（Trichostrongylidae），血矛属（Haemonchus）的捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）引起的寄生虫病。每年为控制该病和其他的线虫病全球估计要花费20亿美元。对捻转血矛线虫病传统的防治方法是使用化学驱虫药和对草原的管理，但随着抗药虫株的出现和蔓延、严重的药物残留和环境污染问题，传统的化学防治方法受到了严峻的挑战。研制安全、有效的疫苗是防治反刍动物捻转血矛线虫病亟待解决的问题，已经有一些疫苗如：组织蛋白酶B（CBL）半胱氨酸蛋白酶显示出对捻转血矛线虫具有保护性。HC58是捻转血矛线虫的序列表达标签，它的部分序列表明它可能是组织蛋白酶B（CBL）半胱氨酸蛋白酶，但与已知的捻转血矛线虫组织蛋白酶B有明显的不同。本论文描述了HC58 cDNA基因全长的克隆和序列分析，原核表达以及重组HC58蛋白的生物学功能特性分析；并检测了用HC58 DNA疫苗免疫山羊后山羊的体液和细胞免疫反应。研究工作如下：1．捻转血矛线虫HC58 cDN堪因的克隆和序列分析根据捻转血矛线虫HC58序列表达标签（GenBank登录号为AF305964）设计5个基因特异性引物，利用3’-RACE和5’-RACE分别获得该基因的3’端未知区（495bp）和5’端未知区（430bp）；从而拼接得到HC58的全长cDNA。从捻转血矛线虫成虫中提取总RNA，以此为模版进行扩增反应。使用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒纯化3′和5′端产物，并克隆到pMD-18T载体，将重组的pMD-18T／3′或5′末端产物分别转化DH_5α大肠杆菌，用XbaⅠ和HindⅢ限制性内切酶对重组的pMD-18T／3′或5′末端质粒进行酶切鉴定，最后通过测序发现所克隆的3′和5′端插入序列与GenBank（acc．no．AF305964）中捻转血矛线虫HC58 EST序列相同，证实所克隆的3′和5′端序列正确。使用SEQ EDIT程序对5′和3′端的序列进行拼接得到HC58cDNA全长序列，全长序列为851bp的HC58cDNA基因拥有着654bp的开放阅读框编码217个氨基酸，此蛋白的等电点为8.431，预测其理论分子量为24，332.70Da。此蛋白归属为AC半胱氨酸蛋白酶家族成员。2．HC58 cDNA在大肠杆菌中的表达和其天然产物的确认捻转血矛线虫HC58cDNA被克隆到pET-28a原核表达载体，重组的pET-28a／HC58cDNA被转化到BL₂₁大肠杆菌中，使用1mM IPTG诱导HC58cDNA的表达，37℃培养4h后，收集细菌，用SDS-PAGE分析表达的蛋白，表达产物为29kDa。重组蛋白以包涵体的方式存在，8Mol／L尿素溶解包涵体，降低尿素的浓度连续透析。使用鼠抗重组HC58血清做Western blot分析检测捻转血矛线虫的天然蛋白，结果显示了一条32kDa的蛋白代替了预测的24kDa分子量的蛋白。此结果暗示天然的HC58蛋白是糖基化的蛋白，捻转血矛线虫表面膜蛋白抽提物（P2）与鼠抗重组HC58血清在32kDa强烈的反应表明HC58天然产物是表面膜蛋白。重组的HC58蛋白与感染捻转血矛线虫山羊的血清反应说明捻转血矛线虫感染后分泌了HC58蛋白，诱导了山羊抗体反应。3．重组HC58蛋白的血球凝集活性采用人的AB、A、B、O型红细胞和山羊、狗、兔、鸡、鼠和水牛的红细胞悬液分别检测了重组HC58蛋白的血凝活性。结果表明，重组HC58蛋白具有血型专一性，在400μg／ml和1.6mg／ml浓度下，对人的AB、A、B和O型红细胞以及犬、兔、鼠和水牛的红细胞具有较高的凝集活性，对鸡的红细胞具有较低的凝集活性；在80μg／ml浓度下，对山羊和鸡的红细胞不发生凝集作用；即使重组蛋白在1.6mg／ml浓度下也不凝集捻转血矛线虫天然宿主山羊的红细胞。此结果说明HC58蛋白可能在捻转血矛线虫的生存中起到重要作用。4．重组HC58蛋白的半胱氨酸蛋白酶活性在体外，在不同的pH值条件下检测重组HC58蛋白的半胱氨酸蛋白酶活性，证实该蛋白具有半胱氨酸蛋白酶家族的特性并能水解Z-FR-AMC和Z-RR-AMC的合成肽底物。在酸性条件下，重组HC58蛋白可显著降解山羊的血红素、免疫球蛋白G和azocasein。相反，在碱性条件下，重组HC58蛋白可降解纤维蛋白素原。半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64存在条件下，重组HC58蛋白的这些活性可被明显地抑制。在体外重组HC58蛋白降解血色素与该蛋白在体内公认的活性相符。这些结果暗示HC58蛋白在捻转血矛线虫的食血过程中可能起到重要作用。5．HC58 DNA疫苗的免疫保护性研究鉴于在捻转血矛线虫体内的生理功能，半胱氨酸蛋白酶是一个有望控制此病有潜力的候选抗原，但对山羊是否具有免疫保护力还未见有资料报道。在这一章里，我们用HC58 DNA疫苗在山羊上做了免疫保护性试验。16只山羊被分成4组，每组4只，在攻虫前的28天和14天用HC58 DNA疫苗免疫两次，二免后的14天，每只山羊感染5，000条三期感染性幼虫。结果显示，在一免和二免后的7天和10天，HC58 DNA疫苗在注射部位的肌肉中进行了转录和表达。攻虫后，第一组（HC58DNA组）的每克粪便虫卵数（epg）、虫卵孵化率和皱胃荷虫数比对照组分别减少28.02％、47.6％和28.3％；第二组（重组HC58蛋白免疫组）比对照组分别减少26.36％，31.6％和16.1％（P＜0.05）。其中，第一、二组的皱胃荷虫数（532.25±143.54和622.5±71.29）显著地低于第四组（未免疫阳性对照组）的皱胃荷虫数（741.5±241.45）（p＜0.05）。攻虫后，免疫山羊血清IgG、IgA和胃粘膜IgA水平显著升高，说明HC58 DNA疫苗有较好的免疫保护效果。6．HC58 DNA疫苗免疫山羊后的细胞免疫反应DNA疫苗在山羊的免疫保护性试验中取得了显著的保护率，但其免疫的机理还不清楚。在这一章里，我们检测了HC58 DNA疫苗免疫山羊后以及攻虫后的细胞免疫反应。攻虫后，免疫组山羊的外周血CD4⁺T、CD8⁺T和B淋巴细胞比未免疫的阴性对照和阳性对照组显著增加；免疫和攻虫后，嗜酸性粒细胞和淋巴细胞水平也显著增加。相反，山羊的外周血嗜中性粒细胞和白细胞显著减少。此结果表明该疫苗的免疫机理是复杂的，由CD4⁺T、CD8⁺T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞共同作用并倾向于向Th2类反应发展。