枯草芽孢杆菌广泛地运用于农业,生防和工业酶制剂生产领域,然而其在生长稳定期,先启动芽孢形成相关基因表达的细胞,同时会启动产孢致死因子(sporulation killing factor,Skf)基因(skf)的表达,杀死那些尚未启动芽孢形成相关基因和对skf表达敏感的营养细胞,从而获得营养并延迟芽孢的形成,最终导致活细胞数和菌体生物量降低,这种现象称为同类相残。枯草芽孢杆菌在形成芽孢的同时合成大量酶蛋白,包括淀粉酶和蛋白酶等,通过敲除产孢致死因子基因是否避免同类相残,是否会在增加菌体生物量的同时,也增加这些酶的合成量,还没有报道。在这项研究中,我们用缺少了8种胞外蛋白酶的枯草芽孢杆菌WB800作为研究对象,通过同源重组的方法,敲除skf基因,从而获得skf缺失菌株,探索在提高WB800生物量的同时,能否提高其淀粉酶的活力。主要结果如下:1、根据枯草芽孢杆菌枯草亚种strain 168的skfABCEF基因序列设计引物,从WB800菌株基因组中分别克隆得到致死因子skfABCEF基因及其上游1140bp和下游591 bp序列,经比对,这些序列与GeneBank中公布的枯草芽孢杆菌多个亚种和其他一些细菌中的skfABCEF基因序列的相似性均达99%。表明,skf基因在枯草芽孢杆菌及其一些近缘的细菌中都是非常保守的。2、通过三步重叠PCR反应,将3个片段分别是skfABCEF的上游同源序列(1140 bp)、四环素抗性基因表达盒(1436bp)和skfABCEF的下游同源序列(591 bp)进行融合,经与pMD19-T Simple连接、扩增后测序,结果表明,构建同源重组敲除skfABCEF基因的DNA片段连接顺序和序列均正确。3、采用spizien改良化学法将同源重组敲除skfABCEF基因的DNA片段导入WB800,得到的拟转化子经继代遗传稳定性检测和PCR鉴定,得到一遗传稳定的转化子WB800的?(skfABCEF)tet~r菌株NO 5。4、LB培养基摇瓶培养转化子NO 5和WB800,培养液的OD值测定结果和显微观察均表明,转化子的菌数和芽孢数均比出发菌株提高108.67%和108.72%。测定培养液中α-淀粉酶的活力,结果表明,转化子与出发菌株相比提高30%~65%。