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研究目的通过观察中药单体甘草次酸对人非小细胞肺癌细胞株A549.NCI-H460的增殖及细胞周期调控的影响,探讨其对人非小细胞肺癌细胞增殖的影响和作用机制,阐述周氏克金岩方中有效成分甘草抗肿瘤的分子生物学基础,从而为临床中医药抗肿瘤治疗提供实验依据。研究方法1.MTT比色法观察不同浓度甘草次酸(3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM)作用于人非小细胞肺癌细胞株A549. NCI-H46024小时、48小时和72小时,对细胞增殖的影响。2.流式细胞术检测不同浓度甘草次酸(3.125μM、12.5μM、24μM、50μM)作用于人非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H46024小时、48小时及72小时后细胞凋亡及周期的变化。3. Western-Blot测定不同浓度甘草次酸(12.5μM、25μM、50μM)作用于人非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H46024小时对细胞周期相关蛋白CyclinD1、 CyclinD3、CyclinE2、CDK2、CDK4、CDK6、 p16、p18、p21、p27, pRb、E2F-1及内质网应激相关蛋白Bip、ERP72、PERK蛋白水平影响。研究结果1.MTT比色法结果表明,甘草次酸对人非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H460的生长具有较强的抑制作用,并在0-50μM浓度范围内具有时间和浓度依赖性。2.流式细胞仪检测显示,经不同浓度甘草次酸作用24、48、72小时,人非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H460细胞周期阻滞在G0/G1期,具有良好的量效关系。3. Western-Blot测定显示,经不同浓度甘草次酸作用24小时后,人非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H460中CyclinD1、CyclinD3、CyclinE2,CDK2、CDK4、 CDK6, E2F-1蛋白表达量下降,p16、p18、p21、p27, pRb蛋白表达量升高,Bip、PERK、ERP72未折叠蛋白表达水平升高。研究结论甘草次酸能明显抑制人非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H460的增殖,诱导非小细胞肺癌细胞周期阻滞于G0/G1期,且能增加A549、NCI-H460细胞p16、p18、p21、p27蛋白的表达、降低Cyclin D1、CyclinD3、CyclinE2, CDK2、CDK4、CDK6蛋白表达,进而抑制Cyclin D-CDK4/6、Cyclin E-CDK2复合物的形成,减少E2F-1蛋白的释放,使pRb保持去磷酸化且结合E2F-1的蛋白状态,使细胞停留在G0/G1期,从而抑制细胞增殖；甘草次酸诱导内质网分子伴侣Bip、ERP72表达增加,活化PERK蛋白,诱导细胞内质网应激反应,激发未折叠蛋白PERK信号通路途径。该研究表明甘草次酸阻滞人非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H460细胞周期于G0/G1期的机制与内质网应激引起未折叠蛋白反应相关,其抑制肿瘤细胞增殖,达到抗肿瘤作用。