半滑舌鳎StAR基因的克隆和表达分析及性别相关基因(FTZ-F1、neurl3)原位杂交分析

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半滑舌鳎是我国一种重要的海水养殖鱼类,由于半滑舌鳎营养价值丰富,具有广阔的养殖前景。并且在发育过程中,半滑舌鳎雌雄差异大,在自然条件下容易发生性逆转。因此,研究半滑舌鳎性别控制的相关基因决定机制是一个十分重要的研究方向。本文通过对半滑舌鳎StAR基因的克隆,发现该基因在半滑舌鳎精巢的表达量明显,推测该基因对精巢的发育和精细胞的发生有密切关系,对半滑舌鳎在性别相关基因的挖掘工作做了很好的基础性工作,为进一步研究性别相关基因提供基础性材料。利用半滑舌鳎性腺转录组测序获得的StAR基因部分序列,设计RACE引物,克隆了半滑舌鳎StAR基因的cDNA序列全长为1294bp,5′端UTR为132bp,3′端UTR为310bp,开放阅读框(ORF)为852bp,共编码283个氨基酸。将半滑舌鳎StAR基因与其他物种StAR基因进行氨基酸同源性分析,结果显示,半滑舌鳎StAR与塞内加尔鳎、大口黑鲈、花鲈、金头鲷的同源性都达到了85℅,和虹鳟、斜带石斑鱼及日本鳗鲡的同源性分别为81℅、83℅和76℅。StAR基因的雌、雄鱼不同组织表达分析表明,StAR基因在雄鱼性腺中高表达,在雄鱼的肝脏、脑及心脏中表达量较低,而在雄鱼的其它组织中不表达;在雌鱼肠中不表达,在其它组织(卵巢、肝脏、脾脏、脑、垂体、肌肉、心脏、肾脏)中微量表达。荧光定量PCR分析不同组织与不同时期性腺表达谱表明,雄鱼性腺中StAR基因的表达量显著高于雌、雄鱼其它各组织(p<0.05),提示StAR基因对雄鱼精巢发育起重要作用。雄鱼不同时期表达谱分析结果显示:StAR基因在66天前的精巢中不表达,在150天时表达量急剧增加,至二龄时表达量最高,三龄时表达量下降,说明该基因在精巢发育成熟过程中起重要作用。原位杂交结果显示StAR基因主要在雄鱼精巢的精子细胞中表达,而在半滑舌鳎雌鱼的卵巢中不表达。通过以上研究表明,StAR基因在半滑舌鳎精巢发育中发挥作用,且可能在精子形成中发挥重要作用,为进一步研究StAR基因在半滑舌鳎生殖调控中的功能和作用机制奠定了重要基础。对早期半滑舌鳎不同发育时期的性腺进行组织学分析。通过观察可以发现该批采集的鱼苗,26d雌鱼、雄鱼都没有发生分化,性腺中聚集大量的原始生殖细胞。46d雌鱼、雄鱼雌鱼没有明显的分化,雌鱼性腺中出现卵原细胞,雄鱼性腺中有精原细胞。66d雌鱼性腺出现多个隆起,卵原细胞增多,66d雄鱼精巢中有输精小管的形成,在此时期已经有明显的分化。86d雌鱼可以观察到明显的卵巢腔的出现,说明卵巢的分化已经正式开始,86d雄鱼也产生了大量的次级精母细胞,有精小叶结构形成,有多个裂隙结构。关于半滑舌鳎早期性腺分化的具体时期还没有明显的界定,因为性腺的发育会受到多种因素的影响,其中温度对半滑舌鳎性腺发育的影响明显。已经证明卵巢的腔的形成为卵巢分化形成的重要标志。通过原位杂交技术,分别对FTZ-F1基因和neurl3基因进行了组织学定位。结果显示FTZ-F1基因在半滑舌鳎的雌鱼和雄鱼中都有杂交信号,但在精巢中的杂交信号明显强烈,随着精巢的成熟杂交信号明显加强,44d的雄鱼主要在精原细胞中信号最强,205d的精巢中杂交信号主要集中在精子细胞中。卵巢中该基因的杂交信号较弱,44d的雌性原始性腺中原始生殖细胞有较弱的表达,在205d的雌鱼卵巢中该基因主要在卵母细胞的膜中表达。neurl3基因原位杂交表达分析结果显示,该基因在半滑舌鳎的精巢中表达信号强,2龄的雄鱼中检测到了该基因的杂交信号,杂交信号主要集中在成熟的精子细胞表达,成年的卵巢中没有该基因的表达。对于三倍体的半滑舌鳎雄鱼也检测到了该基因的表达,但表达程度明显比正常的雄鱼弱。伪雄鱼中成熟的精子细胞表达信号明显。由上述可以推断neurl3基因与半滑舌鳎精子细胞的发生有很密切的联系,很可能是半滑舌鳎精子发生过程中一个重要的基因。该研究结果为半滑舌鳎性别基因的研究提供了相关的理论基础,为更好的开展半滑舌鳎选择育种工作做好相关铺垫。
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