论文部分内容阅读
干细胞治疗是通过在体外对干细胞进行纯化分离、增殖培养然后进行定向诱导分化,通过移植技术将获得全新的细胞、组织和器官等移植到体内,移植部分能够代替正常、损伤或者死亡的细胞,从而恢复机体功能一种细胞疗法。在细胞治疗过程中,干细胞的高效定向分化是至关重要的,全面了解和充分利用影响干细胞分化因素对再生医学具有重要意义。肝素/硫酸乙酰肝素(HP/HS)作为干细胞生态位中结构最复杂的GAGs分子,可通过结构中大量负电荷的羧酸基团和磺酸基团与可溶性信号因子或细胞膜蛋白相互作用,进而特异性诱导胚胎干细胞向神经细胞、间充质干细胞向成骨细胞方向分化。我们通过基团重组策略合成类肝素聚合物,并模拟干细胞生态位微环境,设计人工干细胞生态位微环境平台,探究其对干细胞定向分化的影响。具体研究内容如下:1.首先从宏观3D角度设计人工干细胞生态位平台,我们以3-磺丙基丙烯酸盐钾盐(SPA)、2-(甲基丙烯酰胺基)葡萄糖(MAG)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)为单体单元,进行RAFT聚合制备温敏性多孔水凝胶PNMS,用于封装骨髓间充质干细胞(BMSCs),并探究该平台对BMSCs向成骨细胞分化的影响。通过红外光谱、扫描电子显微镜表征方法对PNMS水凝胶表面拓扑形貌和化学结构进行了表征,结果证明我们成功合成了具有贯穿多孔的类肝素糖聚物水凝胶网络。PNIPAAm、PNMS1%和 PNMS4%凝胶的孔径在 109.64±7.37～161.94±11.84 μm范围内,PNMS7%和PNMS10%的凝胶则表现为大孔层状结构,温度升至37℃时,各组凝胶均表现不同程度的结构致密、孔径缩小的温敏形变行为。并用称重法测试了温敏性PNMS水凝胶的溶胀率和溶胀性能。经CCK-8表征多孔水凝胶对BMSCs和L929细胞均具有良好的生物相容性后,我们从分子水平上检测成骨标志基因探究该功能平台对BMSCs向成骨细胞分化的影响.结果表明成骨诱导分化14天后,相对PNIPAAm的对照组,PNMS4%、PNMS7%和PNMS10%水凝胶均能促进BMSC向成骨细胞的分化。其中,PNMS7%表现出最优的成骨分化潜能,其促进ALP、RUNX2和BGP的mRNA表达量比PNIPAAm对照组分别高约10、17和22倍。PNMS7%温敏性类肝素糖聚物水凝胶为BMSC细胞成骨分化提供有利的人工干细胞生态位平台。2.为了从微观3D角度更加接近干细胞生态位微环境,我们将通过基团重组策略人工合成的类肝素糖聚物PMS和重组可溶性生长因子FGF2协同修饰在具有良好生物相容性的金纳米粒子载体表面,制备AuNP-PMS/FGF2三元复合物。对三元复合材料的稳定性、生物活性和生物相容性进行了相应表征。结果表明,AuNP-PMS/FGF2复合材料在室温下至少能保持8天的稳定性,并能显著促进mESCs向神经细胞分化。与其他材料相比,AuNP-PMS/FGF2复合物能显著刺激mESCs中特异性神经分化标志物(Nestin和β3-tubulin)的表达,而明显下调多能性标志物Oct-4和中胚层标志物Flk1、内胚层标志物Sox17的mRNA表达。此外,在低浓度FGF2(4 ng/mL)时,该复合物对神经成熟标志物β3-微管蛋白表达的促进作用最大,验证了 AuNP-PMS/FGF2复合物在mESCs神经分化中的高效性。同时,在AuNP-PMS/FGF2复合物的作用下,mESCs和L929细胞均表现出良好的生长。AuNP-PMS/FGF2系统为mESCs的神经分化提供了一种有效实现HS/FGF2类似物的新途径。综上所述,人工合成的类肝素糖聚物具有天然肝素/硫酸乙酰肝素(HP/HS)的生物活性,且在不同人工干细胞位生态平台中能够专一高效的促进干细胞的定向分化,这些研究结果为基于类肝素糖聚物的人工干细胞生态位建设提供良好的设计思路。