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研究背景毛发具有十分重要的生理学和社会学的价值,而脱发一直是医学界的一大难题。为此全球各大医药公司每年投入大量的人力物力以寻求治疗脱发的有效疗法。尽管如此,可供选择的治疗手段依然十分有限,而毛囊相关的研究主要受限于缺乏安全高效的药物筛选系统。类器官作为一种由干细胞为原料,经体外培养自我组装成的三维结构,具有与实际器官相似的特征及功能,为研究器官发育、组织再生及疾病发病机理提供了新的可能。近年来,已成功培育多种上皮类器官,例如乳腺,唾液腺以及结肠和肝管,但是在体外培育毛囊类器官仍是一大难题,本研究通过体外悬浮共培养头皮真皮祖细胞及表皮干细胞形成具有毛囊早期发育特征的真皮-表皮细胞聚集体,探究了 WNT信号通路在毛囊类器官形成过程中的作用,并通过体内实验证实其促生发能力,为实现高效培育毛囊类器官提供了新的途径。实验目的1.通过构建真皮祖细胞和表皮干细胞的三维聚集体探索体外培育毛囊类器官的实验方法。2.对成功构建的毛囊类器官进行组织学及遗传学评估。3.探究WNT信号通路在毛囊类器官形成早期发挥的作用。4.探究培育的毛囊类器官在移植后是否可以有效促进毛发生成。实验方法1.依照本课题组创立的“一步消化法”,从新生儿包皮组织中分离原代表皮细胞,并通过克隆形成实验及流式细胞术检测干细胞标志物α6-integrin的表达对表皮干细胞进行鉴定。通过免疫荧光检测相应的特异性标志物对成人及胎儿头皮组织来源的真皮祖细胞多向分化能力进行鉴定。2.将分离的头皮真皮祖细胞和表皮干细胞重悬于配制好的DMEM/F12(3:1)完全培养基中,然后将其接种到低粘附力Costar(?)6-孔板中进行悬浮共培养以形成细胞聚集体。通过倒置显微镜观察细胞聚集体的形态及生长状态。3.将培养成功的真皮-表皮聚集体制成冰冻标本,通过HE染色探究聚集体的构成结构并通过免疫荧光染色检测聚集体中毛囊发育相关基因的表达,对共培养过程中形成的不同真皮-表皮细胞聚集体进行分类及鉴定。4.利用qRT-PCR检测真皮-表皮细胞聚集体中毛囊发育相关基因的表达。5.在悬浮共培养基中加入WNT3a重组蛋白和WNT抑制剂IWP2,观察聚集体的形成并通过qRT-PCR探究WNT通路相关信号分子在毛囊类器官形成过程中的表达。6.通过裸鼠移植检测真皮祖细胞与表皮干细胞体外预聚集构成的毛囊类器官在移植后对毛发再生的作用。实验结果1.从新生儿包皮组织中成功分离出表皮干细胞,传代培养后子代细胞可以形成符合干细胞评价标准的全克隆,并表达表皮干细胞标志物α6-integrin。免疫荧光结果显示,成人及胎儿头皮组织来源的真皮祖细胞在分化诱导后表达成骨、成脂、成肌、成神经的相关标志蛋白,具有多向分化潜力。2.体外悬浮共培养的头皮真皮祖细胞与表皮干细胞自组装为两种类型的聚集体,免疫荧光结果显示其中Ⅰ型聚集体表达毛囊发育早期标志基因,符合毛囊类器官的鉴定标准。3.RT-PCR结果显示,真皮-表皮聚集体中毛囊早期发育相关信号分子差异性表达,其中WNT信号通路在聚集体形成早期被显著激活。4.WNT通路激活剂WNT3a重组蛋白及WNT通路抑制剂IWP-2,可分别促进和抑制毛囊类器官的形成,表明WNT通路的激活是体外成功培养毛囊类器官形成的必要条件。5.胎儿头皮组织来源真皮祖细胞与表皮干细胞经悬浮共培养聚集后在体内移植中的毛发再生效率明显高于未经预聚集培养的头皮真皮祖细胞与表皮干细胞混合液。6.在与表皮干细胞悬浮共培养的过程中,胎儿头皮来源的真皮祖细胞形成Ⅰ型聚集体(毛囊类器官)的效率明显高于成人头皮来源的真皮祖细胞,表明Ⅰ型聚集体的形成能够反映细胞在移植后毛发再生的能力。结论在本实验中,我们建立了可以在体外高效形成大量毛囊类器官(Ⅰ型聚集体)的实验系统,该系统为检测毛发干细胞的生发潜能,评估诱导多能干细胞及促毛囊再生药物的大规模筛选提供了新的平台。此外,我们还证实了WNT信号通路的早期激活是符合毛囊类器官特征的Ⅰ型聚集体形成的必要条件。本研究还清楚地表明,使用胎儿头皮组织来源的真皮祖细胞培育的毛囊类器官在移植后具有良好的毛发再生能力,而使用成年头皮组织来源的真皮祖细胞在体外有效地再生毛囊类器官仍然是一个巨大的挑战。出于伦理学考虑,在科研及临床应用中不宜广泛使用胎儿组织来源的细胞。因此,未来将致力于从诱导性多能干细胞(iPSC)转化为毛囊干细胞,并探索将成年细胞重编程为胎儿样细胞,以取代本实验中的胎儿来源的细胞。