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摘要目的 设计并构建人ERCC1基因shRNA慢病毒质粒表达载体,并建立人卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP稳定转染细胞株,以探索治疗卵巢癌耐药的新方法。方法基因数据库搜索人ERCC1基因序列,并设计3条针对人ERCC1基因的siRNA序列,瞬时转染人卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP,筛选出最有效沉默靶基因的siRNA后,针对其设计并合成能表达其小发卡结构的shRNA序列,与经BamH I和EcoR I进行双酶切的慢病毒载体质粒pLVX-shRNAl连接、转化,挑取筛选的单菌落,经PCR和测序鉴定后提取重组质粒,慢病毒重组质粒pLVX-shRNA1-ERCC1及慢病毒包装辅助质粒psPAX2、pMD2.G共同转染包装细胞293T细胞,收,获病毒上清,测定病毒滴度,转染SKOV-3/DDP细胞,利用嘌呤霉素筛选得到稳定转染pLVX-shRNAl-ERCC1的SKOV-3/DDP细胞株,最后利用RT-PCR鉴定干扰效果。结果PCR和测序鉴定结果证明双链shRNA成功插入慢病毒载体pLVX-shRNA1;共同转染293T细胞得到高滴度病毒,浓缩病毒滴度悬液滴度108IFU以上；转染SKOV3/DDP后获得稳定转染pLVX-shRNA1-ERCC1的SKOV-3/DDP细胞株；PCR鉴定检测到ERCC1 mRNA基因表达显著下降。结论应用RNA干扰技术,能够高效、特异的沉默ERCC1基因的表达,针对卵巢癌ERCC1的RNAi技术,可能成为卵巢癌耐药的临床治疗开拓一条新的途径。摘要目的探讨RNA干扰核昔酸剪切修复偶联因子1(ERCC1)基因表达对人卵巢癌耐药SKOV3/DDP细胞DDP、PGPIPN敏感性的影响。方法通过前期体外设计、合成针对ERCC1基因的RNA干扰双链DNA片段,并转染人卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP,建立稳定转染pLVX-shRNA-ERCC1的SKOV3/DDP细胞株和稳定转染pLVX-shRNA-Negative control的SKOV3/DDP细胞株,将实验分为以下3组：空白对照组(人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP细胞)、特异性转染组(稳定转染pLVX-shRNA-ERCC1的SKOV3/DDP细胞)和非特异性转染组(稳定转染pLVX-shRNA-Negative control的SKOV3/DDP细胞)。采用MTT法测定PGPIPN、DDP对三组细胞的增殖抑制率,RT-PCR法检测PGPIPN对三组细胞乳腺癌易感基因1(BRCA1)基因表达的影响,Western blot法检测PGPIPN对BRCA1蛋白表达的影响。结果MTT法结果显示,PGPIPN作用人卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP 48 h,对其增殖具有一定的抑制作用,在浓度为40、60 mg/L时,与浓度为0 mg/L比较,差异有统计学意义(P<0.05); DDP、PGPIPN分别作用特异性转染组细胞48 h,特异性转染组细胞的增殖明显受到抑制,与DDP、PGPIPN浓度分别为0 m∥L比较,差异均有统计学意义(P<0.05); RT-PCR法结果显示,PGPIPN作用特异性转染组细胞48 h,其BRCA1基因表达随着PGPIPN浓度升高而明显降低,在浓度为40、60 mg/L时,与PGPIPN浓度为0 mg/L比较,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot法结果显示,PGPIPN作用特异性转染组细胞48 h,其BRCA1蛋白表达随着PGPIPN浓度升高而明显降低,在浓度为60 mg/L时,与PGPIPN浓度为0 mg/L比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论PGPIPN对SKOV3/DDP细胞的增殖具有一定的抑制作用,并且通过干扰ERCC1基因表达可以明显增强SKOV3/DDP细胞对DDP、PGPIPN的敏感性,同时可增强PGPIPN对BRCA1基因及蛋白的下调水平。