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本实验室刘梅(2007)将禽流感病毒(AIV)血凝素HA1在苏云金芽胞杆菌表面展示,免疫雏鸡后产生针对AIV H5亚型的特异性抗体,但通过加大免疫剂量和增加免疫次数等措施,特异性抗体效价仅能升至3.8 log2,难以达到实际使用的免疫效果。其原因可能是表达量过少或者表面展示的抗原位点及构型未达到最佳水平。本研究利用生物学软件对H5N1禽流感病毒的HA1蛋白表位进行预测,并通过常规克隆表达方法将不同构型的HA1表位展示在苏云金芽胞杆菌的S-层蛋白中,从而为研制热稳定高效的口服基因工程禽流感疫苗奠定基础。1.H5N1禽流感病毒HA1蛋白表位的预测应用SignalP3.0以及DNAStar等生物学软件对HA1蛋白进行二级结构预测,通过α-螺旋中心、β-折叠区、转角、无规则卷曲、柔韧性、亲水性、表面可能性和抗原性指数的综合分析,确定六个目标片段A、B、C、D、E和F。2.H5N1禽流感病毒HA1蛋白表位的克隆应用primer 5.0软件设计六对引物,以质粒pKG-HA1和pKG-HA1M为模板,进行常规PCR方法扩增,将获得的目标片段克隆到pGM-T载体,得到pGM-A、pGM-B、pGM-C、pGM-D、pGM-E和pGM-F的阳性克隆子。测定结果表明,PCR扩增产物序列与原序列相符,接头处的酶切位点也与设计的相符。利用XbaⅠ+HincⅡ位点将扩增片段连接到质粒pBMB982-304中ctc基因相应的位点处,从而得到一系列含S-层融合蛋白基因的重组质粒pCTC-A、pCTC-B、pCTC-C、pCTC-D、pCTC-E和pCTC-F。利用EcoRⅠ位点将操纵元csaAB插入pCTC-A、pCTC-B和pCTC-E中,得到新的重组质粒pCSHA1A、pCSHA1B和pCSHA1E。3.构建含有HA1表位基因的S-层融合蛋白的重组菌株将重组质粒电脉冲转入苏云金芽胞杆菌BMB171中,分别得到BCA(含pCSHA1A)、BCB(含pCSHA1B)、BCE(含pCSHA1E)、BCCA(含pCTC-A和pMIL-CSA)、BCCB(含pCTC-B和pMIL-CSA)、BCCC(含pCTC-C和pMIL-CSA)、BCCD(含pCTC-D和pMIL-CSA)、BCCE(含pCTC-E和pMIL-CSA)和BCCF(含IoCTC-F和pMIL-CSA)。4.检测外源蛋白在重组菌株细胞表面的表达情况用血凝和血凝抑制试验检测重组菌株的蛋白表面展示情况。结果,部分重组菌株均表现出了预计的生物学活性,说明所构建的S-层融合蛋白基因在受体菌株中得到表达并展示到了细胞表面且具有活性。