新基因MR-1的功能研究

来源 :中国协和医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:aoyun2000
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本研究首先综合采用EST选择、基因组DNA序列分析、PCR反应以及快速扩增cDNA末端(RACE)等技术,从人体骨骼肌cDNA文库中获得了一个755bp的cDNA片段,该cDNA编码蛋白由142个氨基酸组成,位于人类第2条染色体(NT005403.11)上,跨越2887bp片段,由3个外显子组成,命名为MR-1(Myofibrillogenesis Regulatorl,肌纤基因调节因子)。MR-1蛋白序列第75至92位点18个氨基酸形成一疏水跨膜结构域,为一种膜蛋白。采用同源分析法克隆得到其在C57BL/6J小鼠和Wistar大鼠中的同源序列,mMR-1和rMR-1,两者与人源hMR-1基因同源性分别为90.4%和99.5%。生物信息学分析表明MR-1基因在人、大鼠、小鼠、牛和猪等高等哺乳动物中相当保守,而在河豚、斑马鱼、果蝇、玉米、酵母、真菌、疟原虫以及278种已知微生物基因组中无相似序列。 在大肠杆菌BL21(DE3)和BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中采用pGEX-5X-1、pET30和pET24a(+)系统研究了MR-1蛋白的表达。比较了非融合表达,和在MR-1N端融合GST或T7标签序列,和/或在MR-1C端融合His标签序列对蛋白表达的影响。最终采用在N端融合T7标签序列实现了融合蛋白MR-1-T以包涵体形式的高表达。经SDS-PAGE制备凝胶电泳分离、电洗脱纯化获得蛋白,将其作为抗原免疫家兔制备了针对MR-1蛋白的多克隆抗体。 Northern blot和SAGE表达谱分析表明,在人正常组织中,MR-1基因在骨骼肌、心脏、肝脏、肾、肺、结肠、胰腺中均有表达,尤其在骨骼肌及心肌中表达较高,而在乳腺、皮肤、血液中表达很低。其中在21-24岁人骨骼肌中MR-1的转录水平比66-77岁人高约50倍。MR-1基因在多种肿瘤细胞如前骨髓性白血病HL-60、Hela S3细胞、慢性骨髓性白血病K-562、淋巴胚细胞白血病MOL-T4、伯基特氏淋巴瘤Raji、黑色素瘤G-361细胞等表达高,而在结肠腺癌细胞SW480、肺癌细胞A549表达较低。进一步对照分析正常组织与癌组织发现,MR-1在胃癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、脑肿瘤组织/细胞中均有表达,尤其在乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌组织/细胞中表达水平显著高于正常组织/细胞。在乳腺癌细胞MCF-7中MR-1基因受雌激素作用表达上调;而在前列腺癌细胞LNCaP中,其表
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