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干扰素（interferons,IFN）是见于所有有颌类脊椎动物的一大类多效应细胞因子,主要担负宿主抗病毒感染免疫应答功能,不同的病原感染往往倾向于诱导表达出特定的干扰素成员,发现并系统鉴定干扰素新成员对抗病毒感染免疫应答具有重要的意义。固有免疫是机体抵御病原入侵的第一道防线,抗病毒固有免疫反应起始于细胞内模式识别受体（PRRs）。PRRs识别的病原相关分子模式（PAMPs）通过转录因子NF-κB和干扰素调节因子（IRF）（尤其是IRF3和IRF7）来进一步诱导I型干扰素的产生,建立抗病毒状态以促进适应性免疫应答,最终从机体内清除病毒感染,所以I型干扰素在建立抗病毒感染状态和宿主细胞抵抗病毒复制方面具有重要的作用。本研究首先系统分析了牛I型干扰素基因座位,定位到牛的2个干扰素新亚型（IFN-ε、IFN-κ）以及1个包含有2个成员的新亚族（IFN-χ1、IFN-χ3）,随后围绕这四种干扰素的抗病毒信号转导与表达调控进行了一系列的研究,具体研究内容如下:1.牛I型干扰素基因座图谱的构建与分析。综合运用多种在线BLAST方法（BLAST,Basic Local Alignment Search Tool,基本的基于局部比对的搜索工具）对牛全基因组筛选,全面分析各型干扰素的信息,发现牛I型干扰素基因排布于8号染色体上,并进化出了具有鲜明特征的干扰素新家族,其中最为引人注目当属IFN-χ亚族。IFN-χ亚族具有4个成员,具备全新干扰素的特征,组成了1个新干扰素亚族。牛I型干扰素基因座按转录方向分成2个大的亚座位,长度（746kp）分别是人（403kp）和鼠（323kb）的1.85和2.31倍,并且干扰素基因数目（64个）也远超人（17个）与鼠（19个）。在座位末端5个IFN-δ假基因与4个IFN-χ样分子混杂在12个IFN-β样基因之中,并且这些基因的转录方向均相同;基因座其它区域则被数量庞大的IFN-α（13个）和IFN-ω（24个）家族所占据。IFN-κ和IFN-ε仅存在1个拷贝序列,位于基因组的起始端,且IFN-κ的转录方向与IFN-β相反,其与最近的干扰素基因间隔6.561Mb。2.牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-χ1、IFN-χ3的特性和抗病毒信号转导通路。本研究首先从牛肝基因组中克隆得到了牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-χ1、IFN-χ3基因,并分析了这些序列的特征。随后在大肠杆菌表达系统表达了重组牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-χ1、IFN-χ3的成熟肽序列,并制备了抗牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-χ多克隆抗体,在不同的系统上测定了其抗病毒活性。牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-χ1、IFN-χ3均对胰酶敏感,一定程度上耐热（42℃和60℃）耐酸碱（p H2.0和p H10.0）,其抗病毒活性可被特异性多克隆抗体中和,也可被I型干扰素受体IFNAR1和IFNAR2抗体阻断。进一步研究发现牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-χ1、IFN-χ3不仅可诱导干扰素刺激基因（ISGs,如Mx1,ISG15,ISG56）的转录,也可诱导Mx1,STAT1,NF-κB p65的表达,这些分析表明目前已知的I型干扰素成员均依赖JAK-STAT信号通路转导抗病毒信号。3.牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-χ1、IFN-χ3对干扰素信号通路的影响。本试验采用转录组测序的方式分析了在牛睾丸原代细胞上牛IFN-αA和IFN-χ1的调控基因并比较了这些基因的表达差异,结果发现牛Bo IFN-χ1样品处理组有40个差异基因表达上调;Bo IFN-αA样品处理组有80个差异基因表达上调,1个基因表达下调。随后采用荧光定量PCR进一步验证了这些调控基因的在牛源细胞上的表达调控,结果显示上调基因大部分属于ISGs基因,随机选取OAS、Mx1,STAT1、LGP2、GBP4、BST2、PML基因在MDBK、BT、BL细胞上进行验证,证实这些基因在不同细胞上均有不同程度的上调。此外,牛I型干扰素可在BL和BT细胞上启动商品化的人NF-κB-Luc和ISRE-Luc报告载体的荧光素酶活性,并可激活本研究构建的Bo IFNβ-Luc和Bo IFNχ-Luc启动子报告载体的荧光素酶活性,为进一步开展牛固有免疫信号通路的研究奠定了基础。4.牛干扰素信号通路相关分子的研究。维甲酸诱导基因（RIG-I）、黑素瘤分化相关因子5（MDA5）是胞内识别dsRNA的重要模式识别受体,IRF3和IRF7是参与固有免疫应答的重要转录因子,转录因子IRF9参与诱导I型干扰素的产生,ELF4、MAVS、MITA作为信号通路中的接头分子参与诱导I型干扰素的产生。本研究运用RT-PCR的方法从犊牛原代肾细胞中克隆获得了牛接头分子ELF4、MAVS、MITA的c DNA,并分析了其序列特征,组织表达和细胞器定位,重点研究了其对干扰素信号通路的影响。研究表明在不同的细胞上接头分子ELF4、MAVS、MITA能诱导产生不同的I型干扰素,促进信号通路相关分子的转录与表达,还能刺激ISRE、NF-κB、Bo IFN-β和Bo IFN-χ启动子激活的荧光素酶活性,为今后进一步探讨接头分子ELF4、MAVS、MITA在牛感染性疾病中的作用奠定了基础。除了接头分子ELF4、MAVS、MITA基因外,本研究还相继克隆得到了牛干扰素信号通路中的重要分子MDA5、IRF3、IRF7、IRF9、DAI,这为今后研究牛固有免疫奠定基础,同时也为研究牛病原与宿主相互作用提供便利工具。5.3Cpro、Lbpro在牛源细胞上对干扰素信号通路的影响。首先分析了不同刺激物在不同细胞上对I型干扰素及信号通路相关分子转录的影响,结合已有的研究证实FMDV可以拮抗宿主I型干扰素的产生,FMDV的3Cpro和Lpro可以作用在不同的靶分子上来逃避宿主的固有免疫应答,拮抗I型干扰素的产生,本研究进一步发现3Cpro和Lpro不但能抑制I型干扰素的产生,抑制接头分子ELF4、MAVS,RIG-I样受体RIG-I、MDA5,转录因子IRF3、IRF7的转录,还能抑制I型干扰素和接头分子ELF4、MAVS、MITA激活的NF-κB、ISRE、Bo IFN-β、Bo IFN-χ启动子活性。Western Blot结果证实在BT和MDBK细胞上3Cpro和Lpro可以抑制poly（I:C）和Bo IFN-β诱导的NF-κB p65、Mx1、IRF3、IRF7、ELF4、MAVS的表达。总之,本研究系统分析了牛I型干扰素新成员IFN-ε、IFN-κ、IFN-χ的分子特征和生物学功能,初步建立了牛固有免疫信号通路研究的技术平台,利用该平台重点分析了接头分子ELF4、MAVS、MITA对干扰素信号通路的影响,系统地分析了口蹄疫病毒3Cpro、Lbpro逃避固有免疫应答的机制,为病毒免疫预防和抗病毒药物的研制提供理论依据和物质支持。