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聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥是临床应用最为广泛的一种生物粘合材料,常被用作椎体成形术等骨折碎块及假体界面的粘合体。但是,PMMA骨水泥在聚合过程中发生收缩而导致的骨-水泥界面不良微裂隙以及PMMA骨水泥本身的高弹性模量显著增加了椎体成形术后椎体二次骨折的风险。为了解决以上问题,研究者将目光转向PMMA的修饰以及改进。聚丙烯酸(PAA)含有较多的亲水基团,具有独特的吸水膨胀特性,并且生物毒性极低,目前广泛应用于制药、化工等领域。我们课题组前期研究证实,PAA与PMMA物理共混后的骨水泥在产生一定吸水膨胀倍率的同时,还降低了弹性模量。然而该水泥为两种组份的混合物,吸水不均匀导致吸水膨胀倍率有限。因此,进一步优化膨胀骨水泥的构成、提高吸水膨胀倍率、降低弹性模量成为新型骨水泥的研发方向。丙烯酸(AA)与甲基丙烯酸甲酯(MMA)一样,其化学分子式中存在碳碳双键,理论上双键可以打开,两者之间可以共聚结合;聚苯乙烯(PSt)具有良好的机械性能和充分的生物学惰性,能促进聚合物共聚及其强度,同样在生物领域应用广泛。研究表明,苯乙烯(St)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)可通过单体共聚成聚合物。本研究前期成功将甲基丙烯酸甲酯(MMA)、丙烯酸(AA)与苯乙烯(St)进行共价结合,分别得到PMMA-PAA和PMMA-PAA-PSt,将两种新型膨胀骨水泥PMMA-PAA和PMMA-PAA-PSt与PMMA骨水泥进行理化、生物力学、生物学性能及白兔股骨髁部缺损骨水泥填充后骨-水泥界面进行对比研究,从而为骨组织工程和临床包括椎体成形术在内的手术更加仿生奠定试验基础。研究目的:对比两种新型骨水泥与商用PMMA骨水泥在聚合过程中的理化性能,研究新型骨水泥对聚合关键指标的影响;研究两种新型骨水泥在生物力学方面的改变,评价其机械性能;研究三种骨水泥对SD大鼠原代成骨细胞的细胞毒性,对比原代成骨细胞在三种骨水泥表面的增殖与粘附情况;研究三种骨水泥对SD大鼠原代成骨细胞表达成骨相关分子的影响;观察分析三种骨水泥在新西兰白兔体内骨-水泥界面及骨长入情况,为新型膨胀骨水泥的研发提供理论及实验依据。研究方法:一、新型膨胀骨水泥的理化及生物力学性能研究(1)采用排水法检测新型膨胀骨水泥与商用PMMA骨水泥的吸水膨胀倍率。(2)按照国际标准(ISO5833)测定三种骨水泥的凝固时间、凝固温度和面团时间。(3)按照国际标准(ISO5833)测定三种骨水泥的抗压强度和弹性模量。二、新型膨胀骨水泥的生物学特性研究(1)采用CCK-8细胞增殖检测法检测SD大鼠原代成骨细胞在三种骨水泥浸提液中的增殖情况。(2)流式细胞仪检测SD大鼠原代成骨细胞在三种骨水泥浸提液中的凋亡情况。(3)用扫描电镜观察SD大鼠原代成骨细胞在三种骨水泥表面的粘附与增殖情况。(4)利用Western-blot检测大鼠原代成骨细胞在三种骨水泥表面表达成骨相关分子ALP、Collagen I、Runx2、OC/BGLAP的蛋白水平。(5)RT-PCR分析SD大鼠原代成骨细胞在三种骨水泥表面表达成骨相关基因ALP、Collagen I、Runx2、OC/BGLAP的水平。三、新型膨胀骨水泥修复兔股骨髁部缺损的体内研究制作新西兰白兔股骨髁部缺损模型,将三种骨水泥分别注入3个时间组共27只雄性新西兰白兔(2.0-2.5kg)右侧股骨髁部缺损内,于术后第1周通过X线确认骨水泥注入填充效果,并分别于注入填充缺损后第1周、第4周、第12周处死组内各个水泥注入组的3只白兔,切取填充有水泥的右侧股骨,甲醛固定后行切片丽春红染色,观察骨-水泥界面情况。研究结果:一、与商用PMMA骨水泥聚合后体积发生-6.5±0.4%的收缩变化相比,新型PMMA-PAA和PMMA-PAA-PSt骨水泥吸水后体积膨胀率分别为:15.2±0.3%和87.5±0.5%;新型聚合物的面团时间(PMMA-PAA:9.3±0.2 min;PMMA-PAA-PSt:11.3±0.3 min),凝固时间(PMMA-PAA:49.9±0.9 min;PMMA-PAA-PSt:55.6±0.8min)较PMMA骨水泥增加,凝固温度(PMMA-PAA:46.2±0.5°C;PMMA-PAA-PSt:78.9±0.5°C)较PMMA骨水泥降低,并有统计学差异(P<0.05);与PMMA骨水泥(抗压强度:85.6±5.2 MPa,弹性模量:1846.0±201.5 MPa)相比,PMMA-PAA和PMMA-PAA-PSt骨水泥的弹性模量分别降至58.9±3.1 MPa和57.4±5.0 Mpa;弹性模量分别降至1306.4±118.8 MPa and 1468.2±275.8 Mpa,并有统计学差异(P<0.05);但是,PMMA-PAA和PMMA-PAA-PSt骨水泥的抗压强度和弹性模量之间未见明显差异(P>0.05)。二、CCK-8比色法检测细胞增殖活力显示:培养第1、4、7天,PMMA-PAA和PMMA-PAA-PSt骨水泥浸提液组原代成骨细胞增殖明显优于PMMA骨水泥浸提液组(P<0.05);流式细胞检测显示,培养第1、3天,三组骨水泥浸提液组细胞凋亡率与对照组相比明显增高(P<0.05),PMMA骨水泥浸提液组第1、3天成骨细胞凋亡率分别为3.1±0.4%和8.6±1.5%,PMMA-PAA骨水泥浸提液组第1、3天成骨细胞凋亡率分别为2.4±0.2%和6.7±0.8%,PMMA-PAA-PSt骨水泥浸提液组第1、3天成骨细胞凋亡率分别为1.4±0.1%和3.2±0.3%,PMMA-PAA和PMMA-PAA-PSt骨水泥浸提液组原代成骨细胞凋亡率与PMMA骨水泥浸提液组比较明显降低,此结果与CCK-8检测结果相一致;扫描电镜观察细胞生长情况:培养第1、3天,PMMA-PAA和PMMA-PAA-PSt骨水泥表面细胞均完全贴附,充分延展,细胞间连接紧密,PMMA-PAA-PSt骨水泥表面具有独特的“多孔/珊瑚状”结构,更有利于细胞的粘附和伸展。PMMA骨水泥表面细胞成团缩状,未充分延展;Western-blot检测结果表明,培养第3天,PMMA-PAA组Collagen I、Runx2蛋白表达水平高于PMMA组(P<0.05),PMMA-PAA-PSt组ALP、Collagen I、Runx2蛋白表达水平高于PMMA组(P<0.05);培养第7天,PMMA-PAA组ALP、Collagen I蛋白表达水平高于PMMA组(P<0.05),PMMA-PAA-PSt组ALP、Collagen I、OC/BGLAP蛋白表达水平高于PMMA组(P<0.05);RT-PCR分析结果表明,培养第3天,PMMA-PAA组Runx2基因表达水平高于PMMA组(P<0.05),PMMA-PAA-PSt组ALP、Collagen I、Runx2基因表达水平高于PMMA组(P<0.05);培养第7天,PMMA-PAA组ALP、Runx2基因表达水平高于PMMA组(P<0.05),PMMA-PAA-PSt组ALP、Collagen I基因表达水平高于PMMA组(P<0.05),新型骨水泥表面具有一定促进SD大鼠原代成骨细胞表达成骨相关分子的趋势。三、手术后1周X线片显示,三组白兔骨水泥填充缺损部效果良好,未出现骨折及水泥渗漏。股骨髁部切片丽春红染色结果显示术后第1周、第4周PMMA骨水泥切片上可见骨水泥-骨界面存在微裂隙,而PMMA-PAA和PMMA-PAA-PSt骨水泥-骨界面结合紧密。此外,水泥注入体内12周切片丽春红染色结果显示PMMA-PAA和PMMA-PAA-PSt骨水泥与骨接触处骨水泥内出现成骨阳性染色。研究结论:1、新型吸水可膨胀PMMA骨水泥在体外吸水后呈现出优越的体积膨胀性能和低弹性模量。2、体外细胞毒性试验证实新型骨水泥毒性较PMMA骨水泥明显降低;新型PMMA-PAA-PSt骨水泥表面具有独特的“多孔/珊瑚状”结构,更有利于细胞的粘附和伸展;新型骨水泥具有一定促成骨细胞表达成骨相关分子水平的趋势。3、与PMMA骨水泥填充股骨缺损后出现微裂隙相比,新型骨水泥与骨接触更紧密且出现成骨表现。