钙化性主动脉瓣狭窄是一类多发的老年退行性疾病，也是导致成人瓣膜手术最常见适应症之一，主动脉瓣狭窄的发病率随着年龄的增长而逐渐增高。随着我国老年社会化的到来，可以预计该疾病会带来沉重的患者和社会负担。当前药物治疗研究表明对瓣膜钙化中晚期阶段治疗效果疗效欠佳或无效，因此针对瓣膜钙化疾病初期阶段进行早期干预诊治可能是未来治疗策略。基础研究已经提示主动脉瓣狭窄为一主动性进展过程，病理学检查发现钙化性主动脉瓣病理改变包括炎症细胞激活、瓣膜间质细胞功能障碍、成骨细胞转化、细胞外基质异构最终引起钙化结节形成。主动脉瓣膜间质细胞是维持主动脉结构及功能的核心，广泛的分布于瓣膜的三层结构即纤维层，海绵层及心室层。研究发现，在疾病发展过程中，病理切片发现瓣膜间质细胞的呈聚集样生长伴有炎症细胞的浸润，新生血管的形成和细胞外基质的增生最终导致了瓣膜的纤维化及钙化，但目前对于瓣膜间质细胞尤其是人瓣膜间质细胞的生理及病理功能的研究尚在初级阶段。生理及病理条件下主动脉瓣间质细胞的功能均受到多种因素的调节，其中BMPs (骨形成蛋白，bone morphogenetic protein)家族是调节主动脉瓣间质细胞的重要信号通路。经典的BMP通路中BMP结合细胞表面受体启动下游信号蛋白Smads，从而激活一系列下游蛋白并与其他非经典途径共同调节细胞功能。BMP-2被认为是其中刺激瓣膜间质细胞向成骨细胞转化的关键因子，疾病状体下，如动脉粥样硬化，氧化性脂质堆积，肿瘤坏死因子-α等因素均可以通过上调BMP-2通路活性进而加速瓣膜间质的钙化。Msx2及Runx2s是BMP下游的两条主要通路。其中Msx2激活下游的Wnt信号通路，而Runx2是成骨分化特异性转录因子，能上调前成骨细胞、软骨细胞中各种矿化相关蛋白基因的转录，使其向成骨细胞方向分化。此外，Warnock与Jian等发现，了瓣膜间质细胞外形成的凋亡性碱性磷酸酶小体促进了细胞外基质中钙质沉积。综上所述，相比于单纯调控成骨相关性基因的活性，同时阻断BMP-2信号通路及瓣膜间质细胞的凋亡进程，可以更好的达到抑制瓣膜间质细胞向成骨细胞分化的目的。miRNA是近几年在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的RNA，其大小长约20~25个核苷酸，主要发挥基因转录后水平调控作用。作为重要的调节分子，miRNA参与生命过程中一系列的重要进程。miRNA与蛋白结合形成RISC (RNA诱导的转录沉默复合物)后与目标mRNA以碱基互补方式结合,进而降解靶标分子或抑制蛋白的翻译过程。Huang等发现，miR-204通过抑制Runx2的表达活性阻断骨髓间充质细胞想成骨细胞转化。Wu等发现miR-30s可以联合作用于鼠骨髓间充质细胞从而阻断其向成骨细胞分化。近来，对人退行性钙化瓣膜的研究发现，miR-141通过调节BMPs通路途径参与到了瓣膜间质细胞表型转化的过程。但目前对于miRNAs在瓣膜退行性钙化疾病中的作用研究尚处于起步阶段，更多的miRNAs在成骨细胞分化通路中的作用仍有待进一步的研究。综上所述，我们在本课题中旨在通过：1.建立起完善的人瓣膜间质细胞原代培养体系为今后对人瓣膜间质细胞的研究提供充足的材料；2.建立体外瓣膜间质细胞诱导钙化模型为瓣膜钙化研究提供可靠细胞模型；3.通过对临床手术切除标本的分析，寻找退行性钙化瓣膜病可能的致病因素并明确疾病过程中miRNs的表达谱变化；4.通过对miRNA的表达调控，观察发现潜在的瓣膜钙化致病因素。下文将就以上四步分别展开讨论。目的探讨并证实主动脉瓣间质细胞激活与瓣膜退行性钙化之间的相关性，筛查miR-30家族在钙化性瓣膜病中的表达变化。方法收集换瓣手术中切除的老年钙化性退行性病变主动脉瓣作为实验组，为了减小个体差异造成的误差以该患者手术切除瓣膜中的光滑部分组织作为对照组。行HE染色观察瓣膜结构，Von Kossa染色观察瓣膜基质钙沉积，免疫组化染色观察Runx2、Smad1、osteocalcin及caspase-3及分布，Real Timepolymerase chain reaction（RT-PCR）观察上述基因mRNA表达情况。结果HE染色提示退行性钙化病变瓣膜胶原纤维增生，VB染色发现病变瓣膜胶原束排列紊乱。Von Kossa染色提示钙化瓣膜间质内有明显散在点状钙沉积。免疫组织化学染色提示钙化瓣膜内Runx2、Smad1、osteocalcin及caspase-3阳性表达。TUNEL试验证实在钙化瓣膜中存在大量瓣膜间质细胞凋亡现象。 RT-PCR及Western blot提示退行性钙化瓣膜中Runx2、osteocalcin及caspase-3在mRNA及蛋白水平的表达明显上升。在miR-30家族中，miR-30b表达下调最为显著。结论钙化瓣膜内间质细胞表型向成骨样表型转化。Runx2、osteocalcin及caspase-3表达上升提示间质细胞的激活水平及凋亡程度与成骨细胞分化直接相关。目的体外分离和培养瓣膜间质细胞，总结一种方便、快捷、重复性高的瓣膜间质细胞分离培养方法。方法采用胶原酶消化法从人主动脉瓣中分离并体外扩增瓣膜间质细胞。光学相差显微镜每日观察细胞形态。生长良好的2-3代细胞传入培养板，每日计算细胞个数绘制生长曲线。免疫荧光染色及流式细胞仪行细胞表型鉴定，激光扫描共聚焦显微镜观察并拍照。结果胶原酶消化法可成功从人主动脉瓣中分离出间质细胞，1-2周即可获得排列紧密间质细胞单层。间质细胞生长排列呈放射状或漩涡状走行，并可互相重叠生长，生长密集后细胞紧密排列似鹅卵石或铺路石样分布的内皮细胞。细胞生长曲线示间质细胞生长活跃期为传代后2-4天。表型鉴定提示瓣膜间质细胞α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）和波形蛋白（vimentin）免疫荧光染色阳性，内皮细胞血管性假血友病因子（VonWillebrand factor，vWF）染色阴性。结论本研究探索的人瓣膜间质细胞分离培养方法简便、易行、结果稳定、重复性高，是一种理想的瓣膜细胞培养方法。目的建立体外瓣膜细胞钙化模型，诱导主动脉瓣间质细胞钙化，并观察钙化间质细胞外观及表型变化。方法取传代3-7代间质细胞，随机分为2组，实验组以含骨形成蛋白-2（bonemorphogenesis protein-2，BMP-2）β-甘油磷酸、抗坏血酸、地塞米松的钙化培养基进行钙化诱导培养，对照组以标准培养基培养，培养1周。显微镜镜下行von Kossa钙化结节计数，检测碱性磷酸酶活性，荧光定量逆转录聚合酶链反应（Real Time polymerase chain reaction, RT-PCR）检测间质细胞成骨细胞钙化相关因子（Runx2，osteocalcin，caspase-3，Smad1）基因表达。结果培养1周后实验组出现钙化结节，数量显著高于对照组（51.20±14.31/孔VS3.60±1.82/孔，P<0.05），同时钙化诱导组碱性磷酸酶活性较对照组明显升高（约上升4倍，P<0.05），细胞收缩表型α-SMA增高。Real Time PCR及Western blot提示，实验组中成骨相关因子Runx2，osteocalcin及caspase-3在mRNA及蛋白水平表达水平均较对照组明显升高，Smad1在蛋白水平表达上升且差异有统计学意义（P<0.05）结论瓣膜间质细胞可体外成功诱导钙化，钙化间质细胞呈现相对激活状态，表型向收缩表型和成骨表型转化，可能为瓣膜钙化的细胞学基础。目的探讨并证实miR-30b调控瓣膜间质细胞向成骨细胞分化的作用机制并确定miR-30b的靶基因方法收集扩张型心肌病行心脏移植者主动脉瓣及新鲜尸体活检中的瓣膜行人主动脉瓣体外培养。所获细胞3-7代后转至六孔板中，待细胞融合面积达60-80%后分别转染miR-30b mimics (M-miR-30b)，miR-30b inhibitors(I-miR-30b)及miR-对照（miR-NC）。采用上文的钙化诱导培养基诱导瓣膜间质细胞向成骨细胞分化。在线数据库查询miR-30b潜在靶基因。碱性磷酸酶活性测定判断各组中成骨细胞成熟程度，AnnexinV-PI染色观察miR-30b对瓣膜间质细胞凋亡的调控作用。荧光定量逆转录聚合酶链反应（Real Timepolymerase chain reaction, RT-PCR）检测间质细胞成骨细胞钙化相关因子（Runx2，Smad1, osteocalcin和caspase-3）基因表达。Western blot进一步验证上述基因在蛋白水平的表达。最后，构建荧光素酶报告基因载体，通过报告基因实验验证miR-30b靶基因。结果碱性磷酸酶活性测定发现miR-30b显著抑制成骨细胞活性（P<0.05）。流式细胞仪检测凋亡细胞发现miR-30b表达量与细胞凋亡成负作用（P<0.05）。与对照组相比，RT-PCR及Western blot提示miR-30b敲除组中Runx2，osteocalcin及caspase-3在mRNA及蛋白水平的表达明显上升，Smad1在蛋白水平表达上升且差异有统计学意义（P<0.05）。而通过双荧光素酶报告基因实验则证实Runx2， Smad1和caspase-3是miR-30b的靶基因。结论钙化瓣膜内间质细胞表型向成骨样表型转化。miR-30b通过直接的转录后抑制作用于Runx2， Smad1和caspase-3从而阻断了瓣膜间质细胞向成骨细胞转分化