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1目的通过高通量测序筛选强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）湿热证患者外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）差异环状RNA（circular RNA,circRNA）表达谱,观察黄芩清热除痹胶囊（Huangqin Qingre Chubi Capsule,HQC）对AS湿热证患者CircRNA0003307/miR-191-5p/CDK6组合及免疫炎症反应的影响,并从竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ce RNA）角度探讨AS湿热证患者免疫炎症的机制及HQC干预机制。2方法2.1研究一:基于高通量测序的AS湿热证患者PBMCs中CircRNA0003307的变化及临床相关性研究通过高通量测序筛选AS湿热证患者PBMCs中差异表达circRNA,选择免疫炎症关键基因CircRNA0003307,采用生物信息学预测微小RNA（Micro RNA,miRNA）及m RNA,构建CircRNA0003307/miR-191-5p/CDK6组合。观察AS湿热证患者免疫炎症关键基因CircRNA0003307与核因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）信号通路、细胞因子、疾病活动及患者感受（self-perception of patient,SPP）的关系。2.2研究二:基于数据挖掘的黄芩清热除痹胶囊对AS湿热证患者CircRNA0003307/miR-191-5p/CDK6及免疫炎症的影响通过数据挖掘收集AS湿热证患者实验室指标、疾病活动指标及SPP等临床资料,并探讨HQC干预后AS湿热证患者CircRNA0003307/miR-191-5p/CDK6组合、NF-κB通路、细胞因子、疾病活动及SPP的变化情况。2.3研究三:基于ce RNA网络的CircRNA0003307/miR-191-5p/CDK6组合调控关系及介导AS湿热证患者巨噬细胞炎症反应的功能研究分离AS湿热证患者PBMCs,通过磁珠分选巨噬细胞进行体外培养。观察CircRNA0003307、miR-191-5p及CDK6对巨噬细胞免疫炎症的影响。通过双荧光素酶报告基因检测实验、RNA pull down实验、RNA免疫共沉淀实验（RNAimmunoprecipitation,RIP）及细胞功能回复实验验证CircRNA0003307、miR-191-5p、CDK6之间的靶向调控关系。2.4研究四:基于circRNA过表达探讨黄芩清热除痹胶囊含药血清通过CircRNA0003307/miR-191-5p/CDK6调控NF-κB通路抑制AS湿热证患者巨噬细胞免疫炎症反应通过制备HQC含药血清,使用HQC含药血清处理巨噬细胞。观察HQC含药血清对CircRNA0003307/miR-191-5p/CDK6组合、NF-κB通路、免疫炎症的影响,及CircRNA0003307过表达状态下,观察HQC含药血清对CircRNA0003307/miR-191-5p/CDK6组合、NF-κB通路、免疫炎症的影响。3结果3.1研究一:基于高通量测序的AS湿热证患者PBMCs中CircRNA0003307的变化及临床相关性研究（1）与对照组相比,AS湿热证患者组有131个circRNAs出现显著变化,其中89个circRNAs表达上调,42个circRNAs表达下调（P<0.05）;AS湿热证患者组有973个m RNAs出现显著变化,其中644个m RNAs表达上调,329个m RNAs表达下调（P<0.05）。（2）GO分析表明差异基因主要与表皮生长因子激活受体活性的正调控、滋养巨细胞的分化、氧转运等一系列生物学过程相关。通路分析表明差异基因主要涉及TNF、PI3K-AKT、NF-κB信号通路等。（3）与对照组相比,AS湿热证患者肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素（interleukin,IL）-1β、IL-23、IL-17表达明显升高,IL-4、IL-10表达明显降低（P<0.01）;与对照组相比,AS湿热证患者IKBα、NF-κB p65 m RNA表达明显升高（P<0.01）。（3）与对照组相比,AS湿热证患者CircRNA0003307表达明显升高（P<0.01）,相关性分析发现CircRNA0003307与血沉（erythrocyte sedimentation rate,ESR）、C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）、强直性脊柱炎疾病活动指数（bath ankylosing spondylitis diseases active index,BASDAI）、中医证候积分、TNF-α、IL-1β、NF-κB p65成正相关,与生理职能（role limitation due to physical problems,RP）、社会功能（social functioning,SF）成负相关（P<0.01）。（4）关联规则分析发现CircRNA0003307与中医证候积分、CRP、IL-1β、TNF-α、ESR、BASDAI、NF-κB p65、IL-17上升关联度较高,与RP、情感职能（role limitation due to emotional problems,RE）、SF、VT、身体疼痛（body pain,BP）、总体健康（general health,GH）下降关联度较高,提升度均大于1。（5）通过生物信息学构建CircRNA0003307/miR-191-5p/CDK6组合。与对照组相比,AS湿热证患者miR-191-5p表达明显降低,CircRNA0003307、CDK6表达明显升高（P<0.01）。3.2研究二:基于数据挖掘的黄芩清热除痹胶囊对AS湿热证患者CircRNA0003307/miR-191-5p/CDK6及免疫炎症的影响（1）治疗后两组患者CircRNA0003307、CDK6明显降低,miR-191-5p表达明显升高（P<0.05或P<0.01）;而相较于对照组治疗后,治疗组治疗后CircRNA0003307表达明显降低,miR-191-5p表达明显升高（P<0.05）。（2）治疗后两组患者IKBα、NF-κB p65 m RNA表达明显降低（P<0.05或P<0.01）;而相较于对照组治疗后,治疗组治疗后NF-κB p65 m RNA表达明显降低（P<0.01）。（3）治疗后两组患者TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-23、ESR、CRP表达明显降低,IL-4、IL-10表达明显升高（P<0.05或P<0.01）;而相较于对照组治疗后,治疗组治疗后IL-23、CRP表达明显降低,IL-10表达明显升高（P<0.05或P<0.01）。（4）治疗后两组疾病活动各指标均明显改善（P<0.05或P<0.01）;而相较于对照组治疗后,治疗组治疗后BASDAI评分明显降低（P<0.05）。（5）治疗后两组SPP各指标均明显改善（P<0.05或P<0.01）,而相较于对照组治疗后,治疗组能明显改善RE、SF、BP、VT评分（P<0.05或P<0.01）。3.3研究三:基于ce RNA网络的CircRNA0003307/miR-191-5p/CDK6组合调控关系及介导AS湿热证患者巨噬细胞炎症反应的功能研究（1）与对照组相比,AS湿热证患者巨噬细胞中TNF-α、IL-1β表达明显升高,IL-4、IL-10表达明显降低（P<0.01）;与对照组相比,AS湿热证患者巨噬细胞中 CD80、CD86 m RNA表达明显升高,CD163、CD206 m RNA表达明显降低（P<0.01）;与对照组相比,AS湿热证患者巨噬细胞中CircRNA0003307、CDK6表达明显升高,miR-191-5p表达明显降低（P<0.01）。（2）过表达CircRNA0003307后,IKBα、NF-κB p65 m RNA及p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白表达明显升高;敲降CircRNA0003307后,IKBα、NF-κB p65m RNA及p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白表达明显降低（P<0.01）。（3）过表达CircRNA0003307后,巨噬细胞CD80、CD86 m RNA表达明显升高,CD206、CD163 m RNA表达明显降低;敲降CircRNA0003307后,巨噬细胞CD80、CD86 m RNA表达明显降低,CD206、CD163 m RNA表达明显升高（P<0.01）。（4）过表达CircRNA0003307后,巨噬细胞TNF-α、IL-1β表达明显升高,IL-4、IL-10表达明显降低;敲降CircRNA0003307后,巨噬细胞TNF-ɑ、IL-1β表达明显降低,IL-4、IL-10表达明显升高（P<0.01）。（5）CircRNA0003307 positive探针能够显著富集CircRNA0003307和miR-191-5p,表明CircRNA0003307能够与miR-191-5p结合;加入miR-191-5p mimics后,CircRNA0003307、CDK6的WT荧光素酶活性降低;AGO2抗体组中关于miR-191-5p、CDK6基因的富集量显著高于Ig G抗体组。（6）过表达CircRNA0003307能够降低miR-191-5p的表达,升高CDK6的表达,敲降CircRNA0003307能够升高miR-191-5p的表达,降低CDK6的表达;pc DNA-CircRNA0003307上调CircRNA0003307表达后用miR-191-5p mimics转染过表达miR-191-5p,CircRNA0003307及CDK6功能回复。（7）过表达miR-191-5p能够降低TNF-ɑm RNA的表达,升高IL-10 m RNA表达;敲降CDK6能够降低TNF-ɑm RNA表达,升高IL-10 m RNA表达;pc DNA-CircRNA0003307上调CircRNA0003307表达后用miR-191-5p mimics转染过表达miR-191-5p,TNF-α、IL-10 m RNA功能回复。（8）过表达miR-191-5p能够降低IKBα、NF-κB p65 m RNA及p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白表达;敲降CDK6能够降低IKBα、NF-κB p65 m RNA及p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白表达;pc DNA-CircRNA0003307上调CircRNA0003307表达后用miR-191-5p mimics转染过表达miR-191-5p,IKBα、NF-κB p65 m RNA及p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白功能回复。3.4研究四:基于circRNA过表达探讨黄芩清热除痹胶囊含药血清通过CircRNA0003307/miR-191-5p/CDK6调控NF-κB抑制AS湿热证患者巨噬细胞免疫炎症反应（1）CCK8结果显示:当抑制率接近50%时,我们选择20%的含药血清为最佳浓度,24h为最佳作用时间。（2）与模型组相比,HQC含药血清组CircRNA0003307、CDK6表达明显降低,miR-191-5p表达明显升高（P<0.01）;AS湿热证患者巨噬细胞转染pc DNA-CircRNA0003307后,CircRNA0003307、CDK6表达明显升高,miR-191-5p明显降低（P<0.01）;将pc DNA-CircRNA0003307转染的巨噬细胞和HQC含药血清共培养,CircRNA0003307、CDK6明显降低,miR-191-5p明显升高（P<0.01）。（3）与模型组相比,HQC含药血清组IKBα、NF-κB p65 m RNA及p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白明显降低（P<0.01）;AS巨噬细胞转染pc DNA-CircRNA0003307后,IKBα、NF-κB p65 m RNA及p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白表达明显升高（P<0.01）;将pc DNA-CircRNA0003307转染的巨噬细胞和HQC含药血清共培养,IKBα、NF-κB p65 m RNA及p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白表达明显降低（P<0.01）。（4）与模型组相比,HQC含药血清组CD80、CD86 m RNA表达明显降低,CD163、CD206 m RNA表达明显升高（P<0.01）;转染pc DNA-CircRNA0003307,CD80、CD86 m RNA表达明显升高,CD163、CD206 m RNA表达明显降低（P<0.01）;将pc DNA-CircRNA0003307转染的巨噬细胞和HQC含药血清共培养,CD80、CD86 m RNA表达明显降低,CD163、CD206 m RNA表达明显升高（P<0.01）。（5）与模型组相比,HQC含药血清组TNF-α、IL-1β明显降低,IL-4、IL-10明显升高（P<0.01）;转染pc DNA-CircRNA0003307后,TNF-α、IL-1β表达明显升高,IL-4、IL-10表达明显降低（P<0.01）;将pc DNA-CircRNA0003307转染的巨噬细胞和HQC含药血清共培养,TNF-α、IL-1β表达明显降低,IL-4、IL-10表达明显升高（P<0.01）。4结论（1）AS湿热证患者PBMCs中circRNA差异表达,CircRNA0003307与AS湿热证患者NF-κB通路活化、免疫炎症反应、疾病活动相关。（2）HQC能够降低AS湿热证患者PBMCs中CircRNA0003307、CDK6的表达,升高miR-191-5p表达,抑制NF-κB通路活化,改善免疫炎症反应。（3）AS湿热证患者巨噬细胞中CircRNA0003307能竞争性结合miR-191-5p,调控CDK6/NF-κB,介导免疫炎症反应。（4）HQC含药血清通过调控AS湿热证患者巨噬细胞中CircRNA0003307/miR-191-5p/CDK6组合,抑制NF-κB通路活化,改善免疫炎症反应。