多肠目涡虫神经系统cDNA文库的构建及EST分析

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涡虫是扁形动物门(Platyhelminthes)涡虫纲(Turbellaria)的代表动物,三胚层、两侧对称的特性,使它在动物进化中具有重要意义,它是研究发育、再生以及后生动物起源进化的重要模式生物。多肠目涡虫有一对脑神经节成蝶形且中间连接,表面有明显的鞘膜包被,将其与周围的组织分隔开来;神经节的中央主要由神经纤维网组成,神经元胞体主要分布在神经节周边紧邻鞘膜的位置,胞体分区明显。由神经节出发分别向前、后及两侧发出9对神经纤维束,它们之间有横神经相连成网状,遍布全身。本文首次以薄背涡虫(Notoplana humilis)为实验材料构建多肠目涡虫神经系统的cDNA文库,具有代表性,对涡虫的发育及再生机制的研究有重要意义。所构建文库的原始库容为1.1×105,重组率在95%左右,插入片段大小主要集中在500bp~3000bp之间,平均长度约为980bp,满足后续实验的需要。通过对cDNA文库进行序列测定及EST分析,获得了多个涡虫神经系统特异基因,比如FMRF酰胺神经肽前体(FMRFamide neuropeptide precursor)的同源基因、蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatease,PTP)的同源基因、嗅脑cDNA的同源基因和神经内分泌蛋白7B2(putative neuroendocrine protein7B2)的同源基因,还有些基因经Blast比对未找到其同源基因,推测它们可能是涡虫的特有基因。原位杂交组织化学(in situ hybridization histochemistry, ISHH)在当前分子生物学研究中应用广泛。本文通过组织原位杂交技术定位了8个涡虫特异基因在神经系统中的位置,观察这些功能基因的分布,有助于更进一步了解涡虫各神经节分区的功能作用,这为以后分析涡虫发育和再生的表达特异性有至关重要的价值意义。杂交结果显示:这些特异基因的阳性杂交信号大都分布在神经系统的脑神经节,而且不同基因在脑神经节的不同层面上分部不同,推测涡虫的脑神经节开始出现功能分区;有些在沿神经干附近也有阳性反应,推测它们对涡虫的神经传导有影响;有些阳性反应出现在涡虫的卵母细胞中,推测这些基因在涡虫的在早期胚胎发育中起重要作用。为能更明确这些基因的功能,后期可通过基因敲除、RNA干扰等技术来进一步研究这些基因在涡虫的神经发育和再生中的作用。
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