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蚕素是一种与胰岛素结构相关,功能上类似于促前胸腺素的小肽。现已证实,蚕素包含七个家族,其基因编码一个前体分子,包含四个结构域:信号肽、B链、C肽、A链。同时,蚕素蛋白与脊椎动物胰岛素蛋白有一定的相似性。通过生物信息学分析A链和B链的氨基酸序列,显示蚕素的七个家族具有高度的同源性。
本实验室从构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条序列,该序列完整的cDNA全长为690 bp,开放阅读框(ORF)为381 bp,编码126个氨基酸残基,预测其相对分子量为14.12 kD。信号肽预测分析其ORF序列中的1～87 nt为编码信号肽的核苷酸序列,编码29个氨基酸残基。生物信息学分析发现该基因与其他蚕素家族所编码的蛋白有很高的同源性,但又有别于A～G七个家族,故命名为Bombyxin H基因。根据Bombyxin H基因的ORF重新设计引物去除其信号肽序列,通过PCR扩增出目的基因,构建原核表达载体pET-28a-Polh-Bombyxin H,并将其转化大肠杆菌BL21表达菌,经IPTG诱导表达重组蛋白。裂解菌体,SDS-PAGE和Western Bbt检测,融合蛋白正确表达。利用多角体蛋白的性质通过pH值调节、离心及镍柱亲和层析来分离纯化重组融合蛋白,获得Polh-Bombyxin H蛋白,将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。同时,利用家蚕杆状病毒表达系统对Bombyxin H基因进行真核表达,构建三个重组病毒:vBmPolh-Bombyxin H(携带融合多角体无信号肽目的基因);vBmPolh-SP-Bombyxin H(携带融合多角体有信号肽目的基因);vBmSP-Bombyxin H(携带有信号肽的目的基因)。最终将获得的三种重组病毒分别感染正常家蚕BmN细胞和接种蚕蛹,通过Westernbbt和Dot blot分析鉴定,显示出3种重组蛋白在家蚕细胞和蚕蛹中均成功获得表达。由于蚕素和胰岛素及类胰岛素生长因子结构上相似,我们对造模成功的糖尿病小鼠口服正常蚕蛹粉和接种重组病毒vBmBombyxin H的发病蚕蛹粉,结果表明正常的蚕蛹粉和发病的蚕蛹粉较阴性对照相比有明显的降血糖效果,但是正常的蚕蛹粉和发病的蚕蛹粉对小鼠降血糖的效果差别却不是很显著,推测家蚕重组表达的蚕素较所有8种天然蚕素的总量相比仍然偏低,不足以产生显著性差异,后续研究将优化表达条件提高表达量。由于天然蚕素在家蚕中的含量有限,我们利用多角体融合实现对Bombyxin H蛋白的真核表达,为该蛋白的功能研究和应用奠定了基础。