实验目的：卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤,是妇科恶性肿瘤患者死亡的最首要原因。在不同的卵巢癌类型中,上皮性卵巢癌是最常见,也是致死性最高的。其中浆液性卵巢癌是上皮性卵巢癌最常见并且恶性程度最高的类型。由于没有特异性的症状,并且缺乏有效的早期诊断方法,大多数患者发现时已属晚期。虽然手术和放化疗已经获得一定的疗效,但是大多数的晚期卵巢癌患者最终会复发,而且五年生存率不到30%。已经有研究发现,很多分子参与了卵巢癌的发生发展,并对卵巢癌的发展预后具有重要意义。因此,探究卵巢癌特异的、敏感的可用于早期诊断和治疗的新的生物靶点来有效诊断和治疗卵巢癌、提高患者的生存率、延长患者生存时间是迫在眉睫的。cAMP是细胞内一个重要的第二信使,在许多生理和病理过程中发挥了重要的作用。起初,人们认为cAMP的大多数功能都仅仅是通过下游PKA的活化引起的,但是,深入的研究却发现,还有一条非PKA依赖的信号途径,即Epac (exchange protein directly activated by cAMP,由cAMP直接活化的交换蛋白)信号通路。Epac即鸟苷酸交换因子,作为新发现的cAMP的下游信号分子,可以活化Ras样的GTP酶。其家族成员包括两个,即Epac1和Epac2,分别被称为cAMP活化的鸟苷酸交换因子Ⅰ(cAMP-GEF-Ⅰ)和cAMP活化的鸟苷酸交换因子Ⅱ(cAMP-GEF-Ⅱ)。Epacl是多结构域的蛋白,主要包括一个N端的调节区和一个C端的催化区。其mRNA在人体组织器官中广泛分布,发挥重要作用,包括调节分泌、整合素介导的细胞粘附、细胞钙处理、凋亡、心肌肥大、细胞增殖分化和基因表达等等。Epacl被上游cAMP分子活化后,可以引起下游很多信号通路的变化,包括MAPK、mTOR、PI3K/AKT等等,从而引起一系列的功能变化,如钙处理、细胞增殖、存活、炎症、学习和记忆。目前已知Epac1在前列腺癌的增殖、胰腺癌的迁移侵袭和黑色素瘤的迁移中发挥了重要作用,但是,Epacl对卵巢癌的影响目前尚未见报道。本课题探讨的是Epac1下调在卵巢癌中的作用及其机制。首先我们检测了卵巢癌细胞中的Epac1表达,然后在卵巢癌细胞中进行Epacl干扰,检测Epacl下调之后卵巢癌细胞的增殖变化情况,接着进行了通路的研究,从两条信号通路入手：1、MAPK信号通路2、AKT/CyclinD1/CDK4信号通路。最后,用体内裸鼠成瘤实验验证体外实验的现象和机制。实验方法：一、检测卵巢癌细胞系SKOV3,OVCAR3和CAOV3中Epacl的表达情况用real time RT-PCR及western blot的方法检测卵巢癌细胞系SKOV3. OVCAR3及CAOV3中Epac1 mRNA和蛋白的表达情况。二、Epacl:表达下调对卵巢癌细胞增殖能力和克隆形成能力的影响1、选取相对高表达Epac1的卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR3,用Epac1 siRNA分别转染SKOV3和OVCAR3, siControl作阴性对照。RT-PCR鉴定Epac1的干扰效率。2、利用CCK8方法检测Epac1表达下调后对SKOV3和OVCAR3细胞增殖的影响。分别在Oh、24h、48h、72h四个时间点加入CCK8试剂,37℃孵育1h后,450nnm波长处测OD值。3、利用克隆形成实验检测Epacl下调后对SKOV3和OVCAR3细胞克隆形成能力的影响。6孔板中,SKOV3每孔500个细胞,OVCAR3每孔1000个细胞。共培养约2-3周,期间,每隔4-5天换液一次。培养结束,染色：甲醇固定10min,1%结晶紫染20分钟。三、Epacl表达下调对卵巢癌细胞周期和凋亡的影响1、卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR3,用Epac1 siRNA分别转染,siControl作阴性对照。2、利用流式细胞术检测Epacl表达下调后,SKOV3和OVCAR3细胞的细胞周期的变化。转染48h后,收集悬浮细胞及贴壁细胞,计数,使细胞浓度达1×106个/ml。加600μl冷PBS和1400μl无水乙醇(即70%乙醇),-20℃固定过夜。加入含50μg/mL PI,100μg/mL RNaseA的PBS 500μL,40C避光孵育30 min,上机检测。3、利用流式细胞术检测Epacl表达下调后,SKOV3和OVCAR3细胞的细胞凋亡的变化。转染48h后,收集悬浮细胞及贴壁细胞,l×结合缓冲液重悬,计数,使细胞浓度达1×106个/ml。FITC Annexin V和PI双染,室温避光孵育15min。上机检测。需在1小时内检测完毕。四、Epacl下调表达对卵巢癌细胞增殖信号通路的影响1、利用western blot的方法检测Epac1表达下调后,SKOV3和OVCAR3细胞中MAPK信号通路的变化。首先在SKOV3和OVCAR3细胞中干扰Epac1表达,然后通过western blot的方法检测siEpac1组、siControl组及空白对照组中MAPK通路分子p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-P38和P38的变化情况。2、利用western blot的方法检测Epac1表达下调后,SKOV3和OVCAR3细胞中AKT信号通路的变化。首先在SKOV3和OVCAR3细胞中干扰Epac1表达,然后通过western blot的方法检测siEpac1组、siControl组及空白对照组中p-AKT、AKT、CyclinD1和CDK4的变化情况。五、体内裸鼠成瘤实验检测Epacl表达下调对卵巢癌细胞增殖以及相关信号通路的影响1、选用公认的成瘤能力强的卵巢癌细胞系SKOV3进行裸鼠成瘤。体内试验共分三组：NS组、shControl组、shEpac1组。每组雌性裸鼠9只,共27只,需大量培养SKOV3细胞。细胞消化下来,活细胞计数。每只裸鼠注射SKOV3细胞7×106个,体积100μl,用生理盐水稀释,调节细胞终浓度7×107个/ml。用1ml注射器裸鼠腋下注射,然后随机分为3组。2、每天观察肿瘤生长情况,两周后,瘤体大小适当,进行治疗。NS组给予瘤体100μl生理盐水,shControl组给予30μg shControl质粒,shEpac1组给予30μg shEpac1质粒。隔天治疗一次,期间,每天测量瘤体长径和短径。绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤体积,公式：肿瘤体积=长径(cm)×短径(cm)×短径(cm)×0.5。3、治疗约9天后,处死裸鼠,取出肿瘤,测其长径和短径,称量瘤重。然后将肿瘤组织进行石蜡包埋用免疫组化方法检测Epac1表达,提取蛋白用western blot方法检测Epac1及通路分子变化。实验结果：一、Epacl mRNA及蛋白在卵巢癌细胞系SKOV3,OVCAR3中高表达为了确定Epacl在卵巢癌细胞中的表达情况,我们选取三种卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR3和CAOV3。real time RT-PCR和vestern blot的方法测定Epac1 mRNA及蛋白的表达,结果显示Epacl在SKOV3和OVCAR3中高表达,在CAOV3中低表达。于是,我们选择了高表达Epac1 mRNA和蛋白的SKOV3和OVCAR3细胞系进行后续实验。二、特异的靶向干扰Epacl的siRNA可以有效下调SKOV3,OVCAR3中Epac1的表达为了阐述Epac1下调对卵巢癌细胞的影响,我们设计了两条靶向Epacl的特异性小干扰RNA,将它们转染入SKOV3和OVCAR3细胞。用RT-PCR的方法测定干扰效率。结果显示,转染后的SKOV3和OVCAR3细胞Epacl表达量明显减少。三、Epacl下调抑制卵巢癌细胞的细胞增殖和克隆形成能力1、用CCK8细胞活力实验测定Epacl下调对SKOV3和OVCAR3细胞增殖的影响,实验结果显示,Epac1下调之后,SKOV3和OVCAR3的细胞活力均明显下降,说明Epac1下调明显抑制了细胞增殖。2、用克隆形成实验测定Epacl下调对SKOV3和OVCAR3克隆形成能力的影响,实验结果显示,Epacl下调之后,SKOV3和OVCAR3的克隆形成能力均明显下降,说明Epacl下调明显抑制了卵巢癌的细胞克隆形成能力。四、Epacl下调引起卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3的G1期阻滞,但是,凋亡并没有发生明显变化1、流式细胞术的方法检测EpaC1下调对卵巢癌细胞周期的影响,发现转染siEpac1的细胞与siControl相比,G1期细胞数明显增多,说明Epac1下调将SKOV3和OVCAR3的细胞周期阻滞在G1期。2、流式细胞术检测细胞凋亡。结果显示,Epac1下调后细胞凋亡情况与对照组无明显差异。此结果说明,Epac1下调并不能影响SKOV3和OVCAR3细胞的凋亡。五、Epacl下调抑制SKOV3和OVCAR3细胞中p-AKT, CyclinDl和CDK4的表达,MAPK信号通路分子没有明显影响1、在SKOV3和OVCAR3细胞中干扰Epac1表达后,通过western blot的方法检测了MAPK通路分子p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-P38和P38,结果显示,与对照组相比,p-ERK, p-JNK和p-P38并无明显变化。说明在卵巢癌中,Epac1下调导致的增殖的抑制,并不是通过MAPK信号通路发生的。2、在SKOV3和OVCAR3细胞中干扰Epacl表达后,通过western blot的方法检测了p-AKT、CyclinD1和CDK4的变化,结果显示,与对照组相比,实验组p-AKT. CyclinD1和CDK4表达量明显下降。六、在体内荷瘤裸鼠中, Epacl下调明显抑制卵巢癌细胞增殖,也通过抑制p-AKT, CyclinDl和CDK4的表达发挥作用1、在体外,利用RT-PCR和western blot的方法测定新制备的Epac1 shRNA的干扰效果,结果显示,shEpac1可以有效下调SKOV3细胞中的Epac1表达。2、SKOV3进行裸鼠成瘤,约两周后,瘤体长成,进行治疗约九天后,处死裸鼠。生长曲线及肿瘤实体显示,shEpacl质粒治疗的裸鼠瘤体大小明显小于对照组。剥离后的肿瘤体积,重量也是明显小于对照组。3、瘤体病理切片经免疫组化染色显示,Epac1阳性着色位于细胞质而非细胞核,且shEpac1质粒治疗组的Epac1表达明显低于对照组。4、肿瘤组织提取蛋白,用western blot方法检测p-AKT、CyclinD1和CDK4分子表达,发现shEpac1质粒治疗组的p-AKT、CyclinD1和CDK4蛋白表达明显低于对照组。实验结论：1、Epac1 mRNA及蛋白在卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR3中是高表达的,在CAOV3中是低表达的。2、Epacl下调在体外可以抑制卵巢癌细胞的增殖能力、克隆形成能力和细胞周期进程(G1期阻滞),但对细胞凋亡无明显影响。Epac1下调在体内同样可以抑制卵巢癌细胞的增殖。3、Epacl下调对卵巢癌细胞增殖的影响是通过抑制AKT/CyclinD1/CDK4蛋白通路,而非MAPK信号通路。创新性及意义：Epac1是近年来新发现的cAMP下游重要的信号分子,在一些肿瘤的发生发展中发挥了重要的作用,但是在卵巢癌中的作用和作用机制并不清楚。本实验首次发现,Epac1 mRNA及蛋白在卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR3中高表达,在CAOV3中低表达。Epac1通过AKT/CyclinD1/CDK4信号通路对肿瘤的发生进行调节也是首次提出,我们发现,Epac1通过促进p-AKT活化,促进CyclinD1和CDK4的活化,影响细胞周期,进而促进卵巢癌细胞的增殖。我们的实验结果为进一步研究Epacl在卵巢癌中的作用及其机制奠定了基础,也为将来诊断和治疗卵巢癌提供了新思路。