论文部分内容阅读
猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的猪的一种急性或慢性、热性和高度接触性传染病,呈世界性分布,严重威胁着养猪业的发展。我国在猪群中长期使用猪瘟C株兔化弱毒疫苗,效果良好,在一定程度上控制了猪瘟的流行和危害,但是C株兔化弱毒疫苗免疫机体后存在难以区分野毒感染还是疫苗免疫的弊端,不利于猪瘟的净化和清除,因此研制新型标记的猪瘟疫苗显得尤为重要。另外,猪圆环病毒2型（PCV2）和猪细小病毒（PPV）均是危害养猪业健康发展的两个重要病原。PCV2和PPV的混合感染显著提高了断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的发病率,并且能加重母猪尤其是初产母猪的繁殖障碍性疾病。因此,研制安全高效的二联疫苗对防控这两种疾病具有重要的意义。鉴于此,在本实验室研制的猪瘟E2亚单位疫苗的基础上,构建能表达GM-CSF的重组杆状病毒rBac-3GM-CSF,在兔体上评价GM-CSF对猪瘟E2亚单位疫苗的佐剂效应,旨在研制更加安全、高效的猪瘟新型疫苗。另外,在猪体上系统评价ORF2+VP2二联亚单位疫苗的免疫效果。具体内容如下:一、重组杆状病毒rBac-3GM-CSF的构建及亚单位疫苗的制备以pFBD-GM-CSF为模板,PCR扩增GM-CSF,并将获得的GM-CSF插入转移质粒pFBD-GM-CSF得到含有3个拷贝GM-CSF的pFBD-3GM-CSF。然后将pFBD-3GM-CSF转化进入DH10Bac感受态细胞中,蓝白斑筛选纯化后提取得到杆粒rBac-3GM-CSF。PCR鉴定正确后转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒rBac-3GM-CSF。Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明rBac-3GM-CSF能成功表达GM-CSF。分别将种毒rBac-3GM-CSF和rBac-3E2按1.0 MOI接种于悬浮Sf9细胞表达GM-CSF和E2蛋白,将二者混合的细胞悬液与佐剂（ISA201VG）以质量比1:1乳化成E2+GM-CSF亚单位疫苗,使其每头份含E2蛋白40ug和GM-CSF 10ug。另外制备含量为每头份40ug的E2亚单位疫苗。最后,对保存0、3、6月的疫苗的稳定性、黏度和有无细菌等进行质量检测,结果表明制备的亚单位疫苗无细菌污染,各项指标均符合疫苗标准。二、猪GM-CSF对猪瘟E2亚单位疫苗免疫效果影响的研究1、兔体免疫原性试验将制备好的E2+GM-CSF疫苗和E2疫苗分别免疫2月龄的日本长耳大白兔,并以猪瘟C株兔化弱毒苗为阳性对照,PBS为阴性对照。一免后21d加强免疫一次,二免后21d进行猪瘟攻毒保护试验。血清学试验结果表明二次免疫21d后,亚单位疫苗组血清中猪瘟特异性抗体水平达到峰值,平均阻断率达到65%,C-strain组、E2组以及E2+GM-CSF组三者之间无显著性差异（P>0.05）,但是各疫苗组相对于PBS阴性组差异显著（P<0.05）。表明亚单位疫苗组和C-strain组都能诱导兔体产生高水平的猪瘟E2抗体,达到良好免效果。外周血淋巴细胞增殖试验和血清中IFN-γ测定的结果一致,其刺激指数和IFN-γ含量都比PBS阴性对照高（P<0.05）,,表明亚单位疫苗能够诱导机体有效免疫应答的产生。IL-4含量测定结果显示E2+GM-CSF组其含量上调不显著（P>0.05）,但是E2免疫组上调显著（P<0.05）。2、猪瘟攻毒保护试验首次免疫后56d,攻入100个RID50的C株兔化弱毒苗,并监测144h内兔体的体温变化。结果显示阴性对照PBS组体温有升高现象且维持有24h,出现典型的定型热反应;E2+GM-CSF和E2疫苗免疫组兔体的体温均无明显变化。攻毒14天后采取兔的脾脏,通过实时荧光定量PCR测定猪瘟病毒在脾脏中的拷贝数,结果也显示疫苗免疫组体内猪瘟病毒含量明显低于阴性对照组（P<0.05）。E2+GM-CSF组猪瘟病毒拷贝数比E2组要低,且差异显著（P<0.05）。以上结果均表明各疫苗均能对猪瘟病毒的攻击提供100%有效保护,E2+GM-CSF组优于E2组。三、猪圆环-细小（ORF2+VP2）二联亚单位疫苗在猪体上的免疫效果评价将重组杆状病毒rBac-3ORF2和rBac-3VP2（实验室保存提供）分别以1.0 MOI剂量接种Sf9细胞,收集细胞悬液获得猪圆环病毒2型的ORF2蛋白和和猪细小病毒的VP2蛋白,按照一定的比例与赛彼科Gel02佐剂一起混合进行乳化,制备含有效抗原含量不同的ORF2+VP2二联亚单位苗。其中一组为ORF2+VP2（50+80）,另一组为ORF2+VP2（50+100）。将制备好的二联亚单位疫苗保存0、3、6个月,保存期试验结果说明:物理性状指标均符合要求;疫苗均无菌生长。以21d仔猪为模型,评价猪圆环-细小（ORF2+VP2）二联亚单位疫苗的免疫效果。用商业化的PPV灭活疫苗和商业化的PCV2亚单位疫苗为对照组,首免21d后加强免疫一次。分别于0d、21d、42d、63d采血检测血清抗体。血清学结果显示,首免42d时,相比商业化细小疫苗组,ORF2+VP2（50+80）组、ORF2+VP2（50+100）组和圆环商品化疫苗组抗PCV2抗体水平要高,差异极显著（P<0.01）。二联亚单位疫苗组比圆环商品苗抗PCV2抗体水平要高,但差异不显著（P>0.05）。同样首免42d时,相比于商业化圆环疫苗组,ORF2+VP2（50+80）组抗PPV抗体水平要高且差异显著（P<0.05）。商品化细小疫苗组的PPV抗体水平更高且差异极显著（P<0.01）,但是ORF2+VP2（50+100）组的抗PPV抗体水平无差异（P>0.05）。以上结果表明二联亚单位疫苗刺激机体特异性体液免疫产生较高水平的PCV2抗体;也能诱导机体产生PPV抗体的,并且亚单位疫苗中VP2蛋白的含量并不与PPV抗体水平呈正相关。血凝抑制实验结果显示,亚单位疫苗组与商品化细小组PPV抗体水平相当,差异不显著（P>0.05）,比商品化圆环苗要高,差异极显著（P<0.001）。