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目的 建立检测肺孢子菌基因的特异性mtLSU巢式PCR方法，研究其在实验动物肺孢子感染模型的检测效果及其敏感性和特异性，探讨此方法应用于早期诊断肺孢子菌肺炎(Pneumocystispneumonia，PCP)的可行性。将此方法应用于临床呼吸疾病急性发作期患者标本的肺孢子菌基因检测，调查呼吸系统疾病急性发作期患者肺孢子菌定植或感染状况，探讨肺孢子菌感染与呼吸系统疾病的相关性。 方法 依据肺孢子菌线粒体大亚基保守序列设计巢式PCR内、外引物，建立并优化检测肺孢子基因的巢式PCR反应体系。以免疫抑制诱导肺孢子菌感染大鼠模型为检测对象，对比研究mtLSU巢式PCR与环六亚甲基四胺银(GomoriMethenamineSilver，GMS)染色法检测肺孢子菌的检出率及阳性符合率。对阳性标本进行DNA纯化，构建分子克隆，采用倍比稀释法研究mtLSU巢式PCR检测敏感性;以呼吸道感染常见的8种病原体（光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、白色念珠菌、克柔假丝酵母菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体）为对照，检测其特异性。利用新建立的巢式PCR检测呼吸系统疾病急性发作期患者痰液中肺孢子菌基因，分析肺孢子菌在呼吸系统疾病患者中的定植率。 结果 肺印片GMS染色镜检实验组大鼠，14只检测到肺孢子菌包囊，检出率为70％(14/20)，对照组检出率为0(0/20)。用mtLSU巢式PCR均能检测到实验组大鼠肺孢子菌基因，阳性率为100％(20/20)，与GMS染色法阳性率70.0％(14/20)比较差异有统计学意义(x2=4.17，P＜0.05)，对照组均为阴性，与GMS染色的阳性符合率为100％。敏感性检验结果表明，mtLSU巢式PCR扩增的最小量为366fg的肺孢子菌基因。特异性检验，其它8种呼吸道常见病原体的mtLSU巢式PCR的扩增结果均为阴性。测序结果显示，新建立的mtLSU巢式PCR扩增的肺孢子菌基因序列与GeneBank中人源肺孢子菌基因序列同源性为100％。对98例呼吸疾病急性发作期患者的103份呼吸道标本检测的结果显示，肺孢子菌基因检出率为62.14％(64/103)。 结论 本研究建立的mtLSU巢式PCR方法具有较高的敏感性和特异性，适用于无创性呼吸道标本肺孢子菌基因检测;肺孢子菌在呼吸系统疾病患者中有较高的定植和感染率。