卵巢癌是全世界女性最常见的妇科恶性肿瘤之一,每年约有230,000例新发病例,同时约有140,000例死亡。卵巢癌通常发生在颗粒细胞或生殖细胞中,此外>90%的卵巢癌具有上皮组织,并且被认为是由覆盖卵巢表面或包涵体囊下表面的细胞产生的。尽管在早期诊断和细胞毒性以及靶向药物的治疗方面取得了进展,但是只有19%的卵巢癌患者在早期被诊断出来。一旦诊断为晚期只有30%的患者在初始治疗后存活近5年,而其他70%的患者预后差且死亡率高。miRNA是一种微小的内源表达的非编码RNA,其长度接近19-25个核苷酸。近年来许多研究小组已经确定并研究了卵巢癌肿瘤组织中miRNA表达的改变。miR-378被认为是卵巢癌潜在的生物标志物。miR-378包括miR-378a-3p和miR-378a-5p,有研究表明miR-378a-3p可以通过靶向GOLT1A增强他莫昔芬对乳腺癌细胞反应能力。此外,miR-378a-3p是结直肠癌的预后影响因素。然而,关于miR-378a-3p在卵巢癌进展和化疗敏感性的生物学作用和潜在的分子机制尚不清楚。miR-378a-3p在卵巢癌的发生发展中到底起到什么作用,是促进癌症发展还是抑制癌症的发展,引发了我们的思考。因此,我们设计了流行病学实验和细胞学实验来探索miR-378a-3p在卵巢癌中的表达以及作用机制。通过研究其化疗耐药机制,探索miR-378a-3p是否能成为未来卵巢癌临床治疗的靶点。本课题研究内容分以下三个部分:第一部分:62例卵巢癌患者的临床资料统计及生存分析第二部分:miR-378a-3p在卵巢癌中的表达及与卵巢癌细胞和顺铂耐药细胞敏感性的相关性研究第三部分:miR-378a-3p通过靶向MAPK1/GRB2增强对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响。第一部分62例卵巢癌患者的临床资料统计及生存分析目的:卵巢癌是所有妇科恶性肿瘤死亡的主要原因,约占所有癌症的5%,占全球所有女性癌症死亡的4.2%。近年来,尽管在细胞毒性研究和治疗方面取得了进展,但卵巢癌的五年生存率并未有明显提高。这种疾病患者的高死亡率是受多种因素影响的,包括卵巢癌早期无明显特殊症状导致的诊断较晚。另外癌症的耐药性增加更加限制了治疗技术的发展。本研究对河北医科大学第四医院收治的肿瘤内科卵巢癌患者的病历资料进行收集分析,筛选符合本研究纳入标准的患者进行随访,获取相关资料,并分析影响生存时间的因素。方法:选取2010年至2012年在我院肿瘤内科进行诊治,通过病理诊断为各期卵巢癌的患者。在我院完成治疗,并保存了完整的随访资料和病历记录。根据纳入和排出标准共选取合格研究对象62人,进行病例回顾分析,以及生存分析。采用卡方检验、Kaplan-Meier法绘制生存曲线,COX多因素生存分析等方法分析卵巢癌预后影响因素。结果:1.肿瘤大于等于5cm的患者和小于5cm的患者中位生存期分别为35个月和51个月,两者有统计学差异(P=0.000);2.有淋巴结转移的患者和无淋巴结转移的患者中为生存期分别为29个月和47个月,两者有统计学差异(P=0.000);3.临床分期Ⅰ-Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的患者中位生存期分别为47个月、43个月、28个月,三者之间有统计学差异(P=0.022);4.肿瘤组织高中分化和低分化的中位生存期分别为44个月和31个月,结果有统计学差异(P=0.026);5.残余肿瘤直径为0cm、小于1cm、大于等于1厘米的中位生存期分别为58个月、40个月、32个月,差异有统计学意义(P=0.000);6多因素COX回归模型分析结果显示:肿瘤大小、淋巴结转移、病理分期、病理分化、残余肿瘤直径是影响卵巢癌患者五年生存率的因素。结论:1.肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期、病理分化程度以及残余肿瘤直径是影响卵巢癌预后的危险因素。2.淋巴结转移的危险性最高,其次是肿瘤大小、残余肿瘤直径、病理分化程度和临床分期。第二部分miR-378a-3p在卵巢癌中的表达及与上皮性卵巢癌细胞和顺铂耐药细胞敏感性的相关性研究目的:在卵巢癌中,miRNA参与各种细胞功能,从癌变、细胞周期、细胞凋亡、增殖、侵袭和转移以及化疗耐药敏感性。我们旨在研究miR-378a-3p对卵巢癌细胞增殖和顺铂耐药敏感性的生物学效应。首先,分别测定卵巢癌组织和细胞系中miR-378a-3p的表达水平。分析miR-378a-3p表达与卵巢癌患者的总体生存期之间的相关性。随后,设计并进行功能获得性分析以评估miR-378a-3p对卵巢癌细胞系的增殖,凋亡和顺铂耐药敏感性的影响。方法:1.应用实时荧光定量PCR的方法探讨miR-378a-3p在卵巢癌中的表达情况;2.使用Kaplan-meier统计学分析miR-378a-3p与卵巢癌预后的关系;3.应用实时荧光定量PCR的方法探讨miR-378a-3p在正常卵巢上皮细胞IOSE80以及卵巢癌细胞株OVCAR3和SKOV3中的表达情况;4.在OVCAR3和SKOV3细胞中过表达miR-378a-3p,MTT实验检测不同转染组的细胞生长活力,集落形成实验检测不同转染组的细胞其克隆形成率,评价miR-378a-3p对卵巢癌细胞及顺铂耐药细胞增殖的影响;5.在OVCAR3和SKOV3细胞中过表达miR-378a-3p,通过流式细胞技术检测miR-378a-3p对卵巢癌细胞及顺铂耐药细胞凋亡的影响;结果:1.相对于癌旁组织,miR-378a-3p在卵巢癌组织中的表达明显下降,差异显著(P<0.01)。2.与正常卵巢上皮细胞IOSE80相比,miR-378a-3p在卵巢癌细胞株OVCAR3和SKOV3中的相对表达量表达明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。3.miR-378a-3p高表达的患者生存期要高于低水平表达的患者,差异均有统计学意义(P=0.015)。4.根据MTT测定的结果,miR-378a-3p过表达促进了顺铂对OVCAR3和SKOV3细胞的抑制作用,细胞活力明显下降;通过集落形成实验,我们发现miR-378a-3p过表达组卵巢癌细胞的增殖明显减少。此外,当用1μM顺铂处理卵巢癌细胞时,miR-378a-3p模拟物对细胞增殖的抑制作用更有效;5.流式细胞技术检测结果显示miR-378a-3p过表达促进了OVCAR3和SKOV3细胞调亡率,当用顺铂处理卵巢癌细胞时,miR-378a-3p对细胞凋亡的作用更显著。结论:1.与正常卵巢组织相比,miR-378a-3p在卵巢癌组织和癌细胞中表达下降。2.miR-378a-3p与卵巢癌的预后密切相关。3.miR-378a-3p对卵巢癌中具有抑癌基因的作用,抑制卵巢癌细胞的生长和增殖,促进卵巢癌细胞的凋亡,并增加卵巢癌细胞对顺铂耐药的敏感性。第三部分miR-378a-3p通过靶向MAPK1/GRB2增强卵巢癌细胞对顺铂敏感性的影响目的:前部分评估了miR-378a-3p对OC细胞系的增殖,凋亡和顺铂耐药敏感性的影响。因此,在卵巢癌进展中鉴定了miR-378a-3p的抗癌功能。由于miRNA可通过其靶向下游mRNA的3’UTR在人类癌症中发挥致癌或抗癌功能,miR-378a-3p已被证实可通过靶向GOLT1A增加他莫昔芬对乳腺癌细胞反应能力,此外miR-378a-3p可通过抑制HDAC4表达来调节肌肉分化,这可以增强激活p38MAPK信号通路的MEF2C表达。但在卵巢癌中通过何种靶向基因我们尚不清楚,因此本部分进行机制实验以探索miR-378a-3p的下游靶向mRNA。方法:1.分别通过4种不同生物信息学方法(targetScanSites,picTarSites,PITASites和miRandaSites)对miR-378a-3p靶基因进行初步预测及筛选;2.对所预测靶基因构建3’-UTR的荧光素酶表达质粒,与miR-378a-3p的模拟物共转染HEK-293T细胞,通过检测荧光素酶活性进一步明确miR-378a-3p的靶基因;3.应用实时荧光定量PCR的方法探讨MAPK1和GRB2在卵巢癌中的表达情况及其与miR-378a-3p表达的相关性;4.使用Kaplan-meier统计学分析MAPK1和GRB2与卵巢癌预后的关系;5.在OVCAR3和SKOV3细胞中分别转染特异性sh-MAPK1和shGRB2)质粒来敲低MAPK1和GRB2,利用MTT和集落形成实验检测MAPK1和GRB2对OC细胞及顺铂耐药细胞增殖的影响,通过流式细胞技术检测对凋亡的影响;6.在SKOV3细胞中分别转染特异性pcDNA-MAPK1或pcDNAGRB2质粒来过表达MAPK1和GRB2,分别通过MTT实验、集落形成实验以及流式细胞技术检测MAPK1和GRB2对miR-378a-3p作用下OC细胞及顺铂耐药细胞增殖和凋亡的影响。结果:1.通过4种不同生物信息学方法(targetScanSites,picTarSites,PITASites和miRandaSites)预测得到的靶基因取交集,初步得到7个潜在靶mRNA,分别为PAPOLA、MAPK1、KPNA6、GRB2、DYRK1A、ANKRD52、HSPA12A;2.在HEK-293T细胞中共转染7种靶基因的3’-UTR质粒(PAPOLA,MAPK1,KPNA6,GRB2,DYRK1A,ANKRD52,HSPA12A)及miR-378a-3p mimic,双荧光素酶报告基因报告验证结果显示miR-378a-3p模拟物只有效抑制了MAPK1 3’-UTR和GRB2 3’-UTR的荧光素酶活性,而对其余五种mRNA的荧光素酶活性并无影响;3.实时荧光定量PCR结果显示,相对于癌旁组织,MAPK1和GRB2在卵巢癌组织中的表达明显上调,差异显著(P<0.01);此外Spearman’s相关分析显示了MAPK1和GRB2在卵巢癌中的表达和miR-378a-3p的表达均呈负相关;4.经过Kaplan-meier分析结果显示,MAPK1高表达的患者中位生存期低于低表达的患者,GRB2高表达的患者中位生存期低于低表达的患者(P=0.009);5.对OVCAR3和SKOV3细胞用特异性shRNA(sh-MAPK1和shGRB2)质粒转染,MTT和集落形成实验结果均显示MAPK1和GRB2的沉默促进了顺铂对OC细胞系的抑制作用;流式细胞仪检测结果显示MAPK1和GRB2的沉默增强了顺铂对OC细胞系凋亡的作用;6.qRT-PCR和Western Blot结果显示miR-378a-3p过表达可降低MAPK1或GRB2在SKOV3细胞中的表达水平;对SKOV3细胞分别过表达miR-378a-3p和MAPK1或GRB2,MAPK1和GRB2均可逆转miR-378a-3p对SKOV3细胞增殖和凋亡的作用,并且对SKOV3细胞进行顺铂(1μM)处理时,所有上述实验结果更为显著;结论:1.MAPK1和GRB2是OC细胞中miR-378a-3p的两个靶基因;2.MAPK1和GRB2是卵巢癌中的两种致癌基因,影响细胞增殖,凋亡和对顺铂的耐药敏感性;3.MAPK1和GRB2可逆转miR-378a-3p对OC细胞顺铂耐药敏感性的影响。