医用钛合金表面生物功能化改性及生物学性能研究

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钛合金因其优异的力学性能和良好的抗腐蚀性,已成为骨科器械的主体材料。本文针对医用钛合金生物惰性导致与植入部位骨整合性差的问题,以提高植入材料表面活性,缩短骨愈合时间为研究目的,通过在钛合金表面进行层层自组装及构建TiO2纳米管,并在涂层中负载纳米银及microRNA(miRNA),来提高医用钛合金的骨组织修复能力。首先,本文利用多巴胺(DOP)修饰透明质酸(HA),将得到的改性透明质酸(DHA)与壳聚糖(CHI)通过层层自组装技术,在Ti-Nb-Zr合金(TNZ)表面构建聚电解质多层膜(DHA/CHI)。红外光谱与zeta电位测试证明TNZ表面有机多层膜的形成,AFM及接触角测试表明多层膜降低了TNZ的表面粗糙度并增强了TNZ的表面亲水性。DHA/CHI多层膜有利于表面细胞的黏附与增殖。多层膜可促进前成骨细胞的成骨分化,培养35d后细胞的碱性磷酸酶(ALP)与骨钙素(OCN)基因较TNZ有显著性提高(2~3倍)。茜素红染色也显示,DHA/CHI表面涂层促进骨基质的矿化。同时,DHA/CHI多层膜提高钛合金的抗腐蚀性。在电化学交流阻抗测试中,DHA/CHI多层膜表现出电容效应,有一定阻挡电荷转移的能力,减缓钛合金表面腐蚀速率。其次,将DOP改性的海藻酸钠(DAL)与CHI层层组装后,利用DOP自聚合过程中的还原作用,原位制备单质纳米银颗粒(AgNP),在纯Ti表面构建AgNP-DAL/CHI多层膜抗菌涂层。其中银颗粒平均直径为50nm,均匀分散在DAL/CHI多层膜表面。AgNP-DAL/CHI多层膜的接触角约为40°,具有良好的亲水性,并在MTT测试中不表现细胞毒性。AgNP-DAL/CHI多层膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有很好的抑制效果,其抑菌圈直径分别为2.85±0.24mm和2.13±0.15mm,其相对于DAL/CHI涂层的抑菌率提高约在60%左右。再次,采用层层自组装技术,以miRNA-218为模型,将miRNA经转染试剂(RNAiMAX)包裹成的微粒与聚阴离子电解质DAL在纯Ti表面构建了DAL/miRNA基因多层膜涂层。细胞毒性测试表明功能化涂层无细胞毒性。miRNA在多层膜中保持了良好的生物活性。Nanodrop检测显示,miRNA显示出缓释特性,4h时的miRNA的释放量约为1.8pmol/μl,24h后完成释放(4.7pmol/μl)。荧光显微镜下可见miRNA转染进入前成骨细胞质中,培养7d后的ALP活性测试,其吸光度在0.25左右,较Ti与DAL提高约25%。另外,本文采用阳极氧化法制备TiO2纳米管(TNT),通过在TNT中复合胎牛血清(FBS),在纯Ti表面构建了TNT/FBS涂层。SEM结果表明FBS使TNT管壁变厚(由15nm变成50nm),管口直径变细(由150nm变成70nm)。TNT/FBS的表面接触角约为30°,呈现良好的亲水性能。SEM与荧光下可以观察到细胞出现大量片状伪足,表明TNT/FBS复合涂层相对于纯Ti显著促进前成骨细胞的早期黏附。TNT/FBS的FBS负载总量约为30μg/cm2,突释期达到7d,持续释放时间长于Ti/FBS。涂层对细胞增殖的影响顺序为TNT/FBS> Ti/FBS> Ti> TNT。在ALP与OCN基因的表达测试中,对基因表达的促进按照TNT/FBS> TNT>Ti/FBS> Ti的顺序排列,茜素红染色结果同样表明TNT/FBS的促进作用最为明显。最后,本文通过在TiO2纳米管中负载miRNA微粒(miRNA-218),在纯Ti表面构建了TNT/miRNA复合基因涂层。透射电子显微镜(TEM)观察显示,TNT管径在150nm左右,miRNA微粒近似成球形,尺寸约在30~40nm。荧光显微镜下的检测可观测到miRNA在TNT中分布均匀。miRNA负载使TNT的接触角由0°上升为17±3°。Nanodrop检测显示,miRNA在12h内接近零级释放,累积释放量为19pmol/μl。细胞毒性测试表明TNT/miRNA复合基因涂层没有细胞毒性。荧光显微镜下可见miRNA转染进入前成骨细胞质中,随后7d的碱性磷酸酶(ALP)活性测试,其吸光度在0.27左右,较Ti与TNT均有显著性提高。综上所述,层层自组装技术与TNT改性技术可有效提高医用钛合金的表面活性,多层复合膜和TNT可能是生物活性因子的理想载体,纳米银及miRNA负载可有效抗菌并促进骨形成。本文研究的医用钛合金表面生物功能化改性技术有望在骨修复领域得到临床应用。
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