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第一部分缺氧对大鼠生长板软骨细胞软骨表型的影响目的:研究缺氧刺激对大鼠生长板软骨细胞软骨表型的影响方法:1.分离获得大鼠生长板软骨细胞,并利用1%氧浓度刺激大鼠生长板软骨细胞。2.利用CCK-8(Cell Counting Kit-8,细胞计数试剂盒-8)法检测1%氧浓度缺氧刺激对生长板软骨细胞增殖的影响。3.利用RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,逆转录-聚合酶链反应)检测时间梯度下1%氧浓度缺氧刺激后生长板软骨细胞中SOX9(sexdetermining region Y-type high mobility group box protein 9,性别决定区Y型高迁移率族蛋白9)、CollagenⅡ(Ⅱ型胶原)和Aggrecan(聚集蛋白聚糖)基因水平表达的影响。4.利用Western blotting(免疫印迹实验)和免疫荧光的方法检测时间梯度下1%氧浓度缺氧刺激后生长板软骨细胞SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan蛋白水平表达变化。结果:1.缺氧对生长板软骨细胞生长曲线并无明显影响。2.缺氧能够促进SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan基因水平表达的上调,并且呈时间依赖性。3.缺氧能够促进SOX9、CollagenⅡ和Aggrecan蛋白水平表达的上调,并且呈时间依赖性。结论:缺氧促进大鼠生长板软骨细胞软骨表型的维持。第二部分缺氧通过HIF-1α/YAP信号促进大鼠生长板软骨细胞软骨表型的维持目的:研究缺氧刺激对大鼠生长板软骨细胞中HIF-1α和YAP的影响,并研究缺氧刺激下HIF-1α和YAP对软骨表型的影响及其相互作用关系。方法:1.利用1%氧浓度刺激大鼠生长板软骨细胞,并利用RT-PCR、Western blotting和免疫荧光的方法检测时间梯度缺氧刺激后YAP基因水平、蛋白水平表达和亚细胞定位变化。2.利用RT-PCR、Western blotting法检测缺氧刺激下Hippo信号通路中MST1和LATS及p-LATS的表达变化。3.RT-PCR、Western blotting和免疫荧光的方法检测时间梯度缺氧刺激后HIF-1α及其下游VEGF(vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子)基因水平、蛋白水平表达和亚细胞定位变化。4.利用si RNA抑制HIF-1α的表达,Western blotting检测缺氧刺激后SOX9蛋白水平表达变化。5.利用si RNA抑制HIF-1α的表达,Western blotting和免疫荧光检测缺氧刺激后YAP蛋白水平表达和亚细胞定位变化。6.利用si RNA抑制YAP的表达,Western blotting检测缺氧刺激后SOX9和HIF-1α及下游VEGF蛋白水平表达变化。7.软骨细胞缺氧4小时后复氧1小时后,Western blotting检测YAP及下游CTGF(connective tissue growth factor,结缔组织生长因子)、SOX9和CollagenⅡ蛋白水平表达变化。结果:1.缺氧促进YAP基因水平和蛋白质水平表达,并促进YAP的去磷酸化,且呈时间依赖性。缺氧促进YAP核转位。2.缺氧刺激下MST1基因水平和蛋白质水平表达的增加,LATS基因水平和蛋白水平表达上调,但缺氧超过4小时时p-LATS/LATS显著上调。3.缺氧上调HIF-1α及其下游VEGF基因及蛋白水平表达,并促进HIF-1α的核转位。4.抑制HIF-1α的表达可以明显抑制缺氧所引起的SOX9和YAP表达上调,并能够明显抑制缺氧所致YAP核转位。5.抑制YAP表达并不能影响HIF-1α的蛋白水平表达,但可以明显抑制缺氧所引起的SOX9的表达上调。6.缺氧后复氧可抑制缺氧所致的YAP、CTGF、SOX9和CollagenⅡ蛋白水平表达上调。结论:缺氧通过HIF-1α/YAP信号促进生长板软骨细胞软骨表型的维持第三部分氯化钴通过HIF-1α/YAP信号促进生长板软骨细胞软骨表型的维持目的:研究氯化钴对生长板软骨细胞软骨表型的影响,并研究HIF-1α/YAP信号在其中的作用。方法:1.利用CCK-8法检测氯化钴对生长板软骨细胞的毒性作用。2.利用阿利新蓝染色检测氯化钴对生长板软骨细胞细胞外基质合成的作用。3.利用氯化钴对生长板软骨细胞进行时间梯度和浓度梯度刺激,用Western blotting和RT-PCR法检测软骨特异性标志物CollagenⅡ和SOX9基因水平和蛋白水平的表达变化。4.利用氯化钴对生长板软骨细胞进行时间梯度和浓度梯度刺激,用Western blotting和RT-PCR法检测HIF-1α及其下游VEGF表达变化。5.利用氯化钴对生长板软骨细胞进行时间梯度和浓度梯度刺激,用Western blotting、RT-PCR和免疫荧光法检测YAP及其下游CTGF表达变化及YAP的亚细胞定位的变化。结果:1.50-200μM氯化钴对生长板软骨细胞没有明显的细胞毒性作用。2.氯化钴能够明显促进生长板软骨细胞细胞外基质的合成。3.氯化钴可上调软骨细胞中SOX9和CollagenⅡ的蛋白质表达,且呈时间和浓度依赖性。4.氯化钴能够促进HIF-1α及其下游VEGF表达的上调。5.氯化钴能够促进YAP及其下游CTGF表达的上调,并能够促进YAP的核转位。结论:氯化钴通过HIF-1α/YAP信号促进生长板软骨细胞软骨表型的维持。