论文部分内容阅读
腈水合酶(EC 4.2.1.84)是微生物体内代谢臆类物质的关键酶之一,可以催化腈水合成相应的酰胺。由于其催化效率高、反应条件温和、环境友好等特点,腈水合酶已经成功的应用于化学工业中合成酰胺类物质。腈水合酶基因一般以基因簇形式存在,包含α亚基,β亚基和激活蛋白。本实验室前期将来源于Aurantingaas manganoxydans SI85-9A1的腈水合酶基因NH08克隆并构建在重组大肠杆菌中。然而,β亚基的表达量远远低于α亚基,激活蛋白表达量也偏低。本文首先通过融合标签策略、双质粒策略、多顺反子策略等一系列研究,使激活蛋白的表达量提高了 5.14倍,酶活提高了 44.6%,达到120U/mL。其次,通过同义突变策略,使β亚基的表达量提高了 33%,最终酶活达到160U/mL。比酶活达到了 620.2U/mg,提高了 52.9%。再次,通过摇瓶培养条件优化,酶活达到了 1531.2U/mL,OD600达到了 15.6。最后在15L罐中进行高密度发酵,酶活达到了 9080U/mL,OD600达到123。目前谷氨酸棒杆菌被广泛的应用于代谢工程研究中,利用其为宿主进行蛋白表达的研究相对较少。本文首先通过不同组成型启动子与诱导型启动子比较、密码子优化、RBS序列设计和新型mmp诱导系统的应用等表达策略研究,实现腈水合酶在谷氨酸棒杆菌中的高效诱导表达,最终蛋白表达量占总蛋白的29.9%,酶活达到52.4U/mL。其次,通过摇瓶优化,酶活达到了 143.1U/mL,OD600达到了 15.6。最后,在10L发酵罐中进行高密度发酵,酶活达到了 1420U/mL,OD600达到了 200。使用重组大肠杆菌全细胞进行烟酰胺和2,6-二氟苯甲酰胺的制备,最终产物浓度分别达到了 439.2 g/L和314 g/L,转化率都大于99%,具有潜在的应用价值。此外,使用重组谷氨酸棒杆菌全细胞进行烟酰胺的制备,最终烟酰胺的浓度达到了 292.8 g/L,转化率大于99%,证明了利用重组谷氨酸棒杆菌生产烟酰胺的应用潜力。