目的：　　视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）是一组由于基因变异引起视网膜光感受器细胞变性凋亡的遗传性眼病。该病以视力下降、视野缩窄、夜盲、眼底色素沉着以及视网膜电图（ERG）异常为主要临床特点，是一种眼科常见的遗传性视网膜疾病，具有明显的家族遗传倾向。近年的国内流行病学调查研究显示我国的RP发病率约为1/3784，高于世界平均水平，据此保守估计全国约有50-70万患者。迄今为止已发现70多个与该病相关的致病基因，但由于对大多数基因变异的致病机制不甚明了，所以目前尚无十分有效的治疗方法。本研究基于前人在RP遗传病因和致病机理方面的大量研究基础，通过全外显子测序在一个RP家系中初步发现了新型致病基因CEP250，并首次构建与该家系中RP患者相同的CEP250无义突变的基因敲入小鼠模型，进而通过对小鼠模型视网膜形态结构以及功能等的研究，为以后该病发病机制的探索以及将来疾病的基因和干细胞治疗打下基础。　　方法：　　1. 新型RP致病基因的鉴定　　我们在前期临床门诊工作中发现了一个RP家系，先利用目标区域捕获测序技术对先证者进行了所有已知RP基因的突变筛查和分析，排除了该病例是由于已知基因突变引起的，从而提示存在新型RP致病基因的突变。然后采用全外显子测序技术对先证者及其父母进行了基因组编码区及剪切位置的筛查，并结合生物信息学分析、突变致病性分析以及Sanger 测序验证，最终发现了新型候选致病基因。　　2．小鼠模型的构建　　本研究利用TALEN基因编辑技术构建了Cep250基因敲入小鼠模型。主要步骤如下：首先将带有突变信息的基因片段转入小鼠胚胎干细胞中，待其增殖后用Southern DNA印记法筛选出阳性的克隆细胞，再将阳性的克隆细胞通过显微注射法导入C57BL/6小鼠的囊胚中。通过这种方法我们可以得到Cep250杂合突变的小鼠，再将杂合小鼠进行交配，就获得了可用于实验的 Cep250纯合突变小鼠。　　3．小鼠基因型鉴定　　剪取小鼠尾尖或脚趾组织并提取其DNA，然后在事先设计好的引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应将DNA目的片段扩增，最后通过电泳条带来鉴定小鼠基因型。PCR主要分为如下5个步骤：预变性温度95℃，时间5分钟；变性温度95℃，时间30 秒；退火温度60℃，时间30秒；延伸温度72℃，时间1分钟，共计35个循环，循环结束后72℃延伸5分钟，然后冷却保存在4℃。　　4．视网膜结构及功能检测　　（1）视网膜电图　　将充分暗适应后的小鼠按0.004ml/g剂量麻醉后置于Micron IV配套动物台架上，充分散瞳后于角膜表面滴1滴甲基纤维素（2%）以保持其湿润，再将参考电极和地电极分别插入小鼠头部和尾巴根部的浅层皮肤内，然后调整Micron IV-ERG探头（角膜电极）与小鼠眼球相对位置，使得小鼠待测眼与角膜电极恰当接触。仪器与小鼠连接好以后开始梯度光强刺激，依次记录视杆细胞反应、视锥细胞反应的电生理信号。　　（2）OCT、眼底照相及眼底荧光造影（FFA）　　将小鼠麻醉后置于Micron IV配套动物台架上，充分散瞳后在小鼠角膜表面涂抹眼用凝胶迪可罗，打开眼底照灯光，在电脑显示器OCT软件成像介面上找到小鼠眼球位置，调整小鼠与镜头的相对位置后将眼底照镜头向前推进，同时调整光强及焦距，最后使视网膜成像清晰，然后开始视网膜层面扫描，同时进行眼底照拍摄；同样按上述步骤固定好小鼠，再按0.01ml/g的剂量腹腔注射荧光素钠，待荧光扩散至视网膜血管后，在钴蓝光下进行眼底血管的成像。　　5．免疫荧光染色　　将待实验的小鼠麻醉后安乐处死，解剖获得完整的视网膜组织，经过固定、脱水、包埋等一系列步骤后，制备成组织包块，再在冰切机上做连续切片，最终选取合适位置处的视网膜组织切片，留待进一步染色处理。染色基本步骤如下：首先用PBS清洗掉组织上残留的包埋凝胶，孵育一抗后在4℃环境下过夜后使得抗体与组织蛋白充分结合，继日用PBS将一抗清洗干净，接着在室温下孵育二抗，最后加DAPI染核，小心封片后在共聚焦显微镜下选取特定的激光通道进行成像。　　6．细胞凋亡染色　　为了探究Cep250基因敲入小鼠视网膜光感受器细胞是否发生凋亡，我们对该小鼠视网膜切片进行了TUNEL染色实验。具体采用Promega公司的DeadEnd?Fluorometric TUNEL System试剂盒来进行实验。　　结果：　　1. 发现了新型RP候选致病基因CEP250。利用目标区域捕获测序技术对先证者进行了所有已知RP基因的突变筛查和分析，排除了该病例是由于已知基因突变引起的，从而提示可能存在新型的RP致病基因。然后采用全外显子测序技术对先证者及其父母进行了基因组编码区及剪切位置的筛查，并结合生物信息学分析、突变致病性分析以及Sanger测序验证，最终锁定了新的RP候选致病基因CEP250。　　2. Cep250纯合突变小鼠视网膜功能显著受损。视网膜电图检测显示，从出生后第3个月开始纯和小鼠视网膜明视和暗视ERG反应波形下降，提高光刺激强度后纯合鼠各波振幅依然明显低于野生型，且这种视网膜的功能的损伤一直持续到六月龄以后，是一种不可逆的视力损害。　　3．Cep250纯合突变小鼠视网膜厚度变薄。由OCT及眼底照可见，纯合小鼠视网膜厚度减少，其中以外核层厚度的变化最为明显，此外眼底荧光造影还发现视网膜血管出现渗漏现象。　　4. 视网膜光感受器相关蛋白发生变化。免疫荧光染色实验发现，与正常成年对照组小鼠相比，纯合小鼠的光感受器细胞外节蛋白Rhodopsin出现一定的迁移障碍，此外在内外节交界处纤毛相关蛋白GT335和Rab8的信号强度都有所下降。　　5. 视网膜细胞发生了凋亡。凋亡实验显示，成年纯合突变小鼠视网膜外核层凋亡信号明显增多，提示该部位的细胞发生了凋亡。　　结论：　　利用新一代测序技术，我们发现了新型RP致病基因CEP250，并通过动物模型对该基因的功能进行了进一步的探索。目前的研究结果显示，该基因纯和突变小鼠视网膜结构和功能都显著受损，相关表型和人类RP患者之间高度一致。CEP250是一种重要的纤毛相关基因，它主要通过调控纤毛的生长发育来影响内外节的物质转运。该基因功能的缺失之所以会引起视网膜结构的破坏和功能的受损，这可能因为它的缺失会导致部分光感受器细胞的发育障碍。综上所述，我们的基因敲入小鼠模型很好地模拟RP疾病的发生和发展，而且也为该基因的后续研究以及未来人类RP基因治疗提供了坚实的理论基础和实验依据。