探针熔解曲线分析在HBV基因诊断中的应用研究

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乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染导致的慢性乙型肝炎是一个全球性的公共卫生安全问题。目前,慢性乙型肝炎的个体化治疗越来越受到重视,一个最佳的个体化治疗方案的制定离不开患者体内HBV的基因诊断信息。在临床上,real-time PCR技术已被广泛地应用于HBV基因组的定量。对于HBV基因分型和HBV耐药突变的检测,目前急需建立一种简便高效的临床检测方法。针对这个问题,本论文以探针熔解曲线分析技术(melting curve analysis,MCA)为平台,围绕方便快捷的HBV基因分型方法和HBV耐药突变检测方法的建立展开了研究。   第一章,对HBV以及其感染后的危害进行了简单介绍,解释了HBV基因定量的临床意义,阐述了HBV基因分型和HBV耐药突变检测在慢性乙肝个体化治疗中的重要作用,总结了常用的HBV基因诊断方法。最后,介绍了探针熔解曲线技术并提出将其应用于HBV的基因诊断。   第二章,建立了单管四色的HBV基因分型检测体系,能在一个PCR反应管中区分A-H8种HBV基因型。体系的特异性高,检测下限能达到10copies/反应,能明显区分10%以上的混合基因型感染情况。在对283份血清标本的检测中,只检出B和C两种基因型,检测结果与测序结果一致率达到100%。   第三章,建立了两管四色的HBV耐药突变检测体系,仅在两个PCR反应管(A和B)中就能检测包含10个耐药突变位点的23种突变类型,反应体系A能检测9种耐药突变,反应体系B能检测14种耐药突变。体系检测灵敏度达到10 copies/反应,能有效检出10%以上的突变比例。在对389份血清标本的检测中,共有112份标本检出了耐药突变。以测序方法为对照,耐药突变标本检出一致率为100%(112/112),总的位点检测结果一致率达到99.7%(2114/2120)。  
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