中国大鲵Dmrt基因克隆及不同年龄阶段组织表达分析

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Dmrt基因家族编码蛋白是一种包含DM结构域的转录调节因子,该结构域是在果蝇Doublesex(Dsx)基因和线虫Maleabnormal-3(Mab-3)基因这两个性行为调节因子中首次发现的一种DNA结合基序,因其在性别决定和分化方面的功能而被深入研究,并在无脊椎动物和脊椎动物中得到广泛鉴定。本研究通过RACE及同源克隆技术扩增获得了中国大鲵Dmrt1/2/3/A1/A2基因c DNA序列,并对各基因进行了编码蛋白序列分析,同时选取了NCBI上已公布的其他脊椎动物Dmrt基因的核苷酸编码序列构建了系统发育树。通过荧光定量实验探究中国大鲵Dmrt基因在雌雄个体各年龄阶段不同组织中的表达情况,重点分析了Dmrt基因可能在中国大鲵性腺发育中存在的调节功能以及各基因在雄性性腺发育过程中的相互作用。最后结合中国大鲵其他性腺发育相关基因Fox L2、Cyp19a、Sox9在不同年龄阶段睾丸中的相对表达水平,探讨Dmrt1基因与以上三个基因在中国大鲵睾丸发育过程中可能存在的相互作用。得到以下结果:1.中国大鲵Dmrt1基因c DNA序列全长1135bp,编码344aa;Dmrt2基因c DNA序列全长1542bp,编码513aa;Dmrt3基因c DNA序列全长1989bp,编码440aa;Dmrt A1基因c DNA序列全长1486bp,编码431aa;Dmrt A2基因c DNA序列全长1515bp,编码450aa。编码蛋白均含有一个DM结构域和核定位信号区,Dmrt3、Dmrt A1和Dmrt A2编码蛋白还含有DMA结构域,说明以上结构域对中国大鲵Dmrt基因能在体内发挥其保守的转录调节功能十分重要。非洲爪蟾的性别决定基因编码蛋白DMW较短,这可能是在进化过程中对与性别决定无用序列的删除。N-糖基化和磷酸化两种常见的蛋白修饰作用对于Dmrt蛋白与DNA结合可能影响不大,DM结构域外的分布形式保障了DM结构域的稳定性。2.系统进化分析发现脊椎动物Dmrt基因整体聚成7个小支,Dmrt A基因可能是Dmrt基因家族的祖先序列。中国大鲵作为两栖类与吃皮小蚓螈(Microcaecilia unicolor)和双条吻蚓(Rhinatrema bivittatum)聚在一起位于外围,说明了两栖类古老的进化地位以及他们之间具有较近的亲缘关系,在功能方面具有一定借鉴性。3.中国大鲵Dmrt基因在性腺的表达情况具有明显的时空特异性与雌雄差异性,其中Dmrt1、Dmrt3和Dmrt A1都是偏雄性表达基因,Dmrt2是唯一一个偏雌性表达基因,Dmrt A2在早期偏雄表达,4龄时偏雌表达。中国大鲵Dmrt基因可能对雌雄性腺的生长发育,性成熟及配子发生都具有一定作用。在雄性中国大鲵性腺中,Dmrt1和Dmrt3可能具有协同作用,在雌性性腺中Dmrt2和Dmrt A1可能具有相互拮抗的作用。而由于Dmrt1在1龄雄性性腺的表达量不高,但Dmrt3、Dmrt A1和Dmrt A2在此阶段都拥有较高的表达量,说明在1龄,这三个基因可能合作调控早期性腺的发育。除了中国大鲵Dmrt1基因,其他Dmrt基因在性腺外的组织都有检测到表达量,其中Dmrt A2基因在其他组织检测到的表达量很低,推测中国大鲵Dmrt1是性腺特异性表达基因,Dmrt A2可能主要在性腺和大脑发挥作用。4.中国大鲵Dmrt1、Sox9、Fox L2和Cyp19a在睾丸发育中可能存在以下相互作用:中国大鲵Dmrt1可能通过间接激活Sox9的转录来促进睾丸的生长发育。而Sox9可能主要参与的是雄性性腺的发育及性成熟过程,对后期性功能的维持作用不大。与此同时,Dmrt1在雄性性腺生长发育及性成熟阶段可抑制Fox L2的表达。Cyp19a可能在雄性中国大鲵性成熟时期对性腺的成熟以及对精子发生均具有一定影响,但Fox L2和Cyp19a在雄性性腺中是否存在调控关系还有待进一步研究。脊椎动物的Dmrt1还可能通过与其他基因相互作用来诱导睾丸发育及精子的发生,但涉及的相关基因及信号通路在中国大鲵中还未知,需进一步阐明。
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