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1988年Giguere以雌激素受体DNA结合域(DBD)的cDNA为探针,采用低严谨杂交技术筛选人cDNA文库得到了一种新的受体,命名为雌激素相关受体(ERRs)。ERRs是一种孤儿核受体,至今尚未鉴定出相应的配体。经多年的研究显示,ERRs在胚胎发育、真核生物基因表达调控、细胞的生长与癌变以及骨形成与重塑等方面发挥重要作用。ERRe参与了骨形成及骨质疏松的发生<[1]>。
本室在人肺癌细胞A549中利用mammalian two hybrid assay筛选到能够有效抑制蛋白质活性的植物性雌激素单体物质,该单体能够通过ERRot有效的抑制肺癌细胞的生长。因此,为深入研究植物性雌激素通过ERRα对人肺癌细胞的抑制作用,我们检测了细胞的生长对细胞是否凋亡进行了判断,并进行了ROS等各项生化指标的测定。利用体外合成的针对ERRα小干扰RNA对人肺癌细胞A549进行转染实验,并检测某些基因的表达;利刚慢病毒介导的RNA干扰技术特异性沉默人肺癌细胞A549中ERRα基因的表达,包装病毒并成功侵染目的细胞,从而进一步分析该基因沉默后对肺癌细胞的影响。
实验结果表明,加入我们利用mammalian two hybrid assay筛选出的植物性雌激素单体(浓度为10uM)24小时后,能够明显抑制人肺癌细胞A549的生长,细胞表现出凋亡的特征,形态表现为细胞缩小、核断裂、质膜出芽、凋亡小体形成的细胞死亡。生长曲线显示细胞增殖明显受到抑制,48小时后抑制效应达到60%,继续观察发现细胞几乎停止生长。对细胞进行ROS的检测,48小时后与对照组相比加入植物性雌激素单体(浓度为10μM)的ROS升高了2倍。
体外合成的针对ERRα小干扰RNA对人肺癌细胞A549进行转染后,利用real time PCR技术检测相关基因的表达,PDK4基因表达量一定程度上受剑了抑制。于是建立了慢病毒介导的RNA干扰技术,从而达到沉默目的基因的作用,进而组装具有沉默功能的病毒,利用病毒侵染肺癌细胞A549检测基因沉默后对细胞的影响,为以后的研究奠定了基础。