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目的探索心肌梗死后缺血性心衰患者心肌局部组织T细胞的病理性浸润情况,并进行细胞功能和表型分析。方法1)收集接受原位心脏移植手术的急性ST段抬高型心肌梗死后缺血性心衰（Ischemic heart failure,IHF）患者的左心室心肌组织样本（n=5例）,并采集同一患者的5ml外周静脉血。同时收集相同部位的正常心肌样本组织（n=5例）。2)常规伊红-苏木素（Hematoxylin-eosin,HE）染色法评估一般病理组织学特征,免疫荧光法检测心肌组织内CD3+,CD4+和CD8+T细胞的浸润。同时进行CD3与心肌纤维化标记Collagen-I,细胞增殖标记Ki67,BDCA-3型DC细胞标记C型凝集素结构域家族9成员（C-type lectin domain containing 9A,CLEC9A）和巨噬细胞标记（CD68和HLA-DR）的共定位分析。3)利用Liberase TH组织消化酶消化心肌,分离心脏单个核细胞（白膜层细胞）和外周血单个核细胞（PBMCs）。流式细胞术检测心脏单个核细胞和PBMCs的CD8+和CD4+αβT细胞的数量和比例;检测IHF患者外周血和心脏T细胞中CD45RA+CCR7+初始T细胞（Naive T cells,Tnaive）,CD45RA-CCR7+中央记忆型T细胞（central memory Tcells,TCM）,CD45RA-CCR7-效应记忆型T细胞（effector memory T cells,TEM）和CD45RA+CCR7-终末分化效应记忆型T细胞（CD45RA+effector memory T cells,TEMRA）在CD8+和CD4+αβT细胞中的比例;检测IHF患者心脏和外周CD4+T细胞中IFN-γ+Th1,IL-4+Th2,IL-17+Th17和Foxp3+Treg的比例,以及CD8+T细胞中IFN-γ+/GZMB+/PRF1+的比例。4)实时定量PCR检测IFN-γ,IL-4,IL-17,FOXP3,GZMB,PRF1,IL-6和HLA-DR在IHF患者心脏和正常心脏组织中的表达情况。结果1)常规HE染色显示IHF患者心脏组织的大量纤维化病变区域内有炎症细胞浸润;2)免疫荧光结果显示,IHF患者心脏中浸润的CD4+和CD8+T细胞数量显著多于正常心脏,CD3+T细胞主要出现在IHF患者心脏组织的纤维化病变区域,其中可见Ki67阳性的CD3+T细胞。可见CLEC9A+DC细胞和HLA-DRhighCD68+巨噬细胞等抗原提呈细胞与CD3+T细胞有共定位;3)流式细胞术分析显示,每克病变心肌组织中的CD4+和CD8+T细胞数量显著多于正常心脏,心脏CD4+和CD8+T细胞数量无明显差异;相对于外周血T细胞,心脏T细胞的CD4/CD8比例显著降低;4)相较与外周血,IHF患者的心脏CD4+T细胞的TCM比例显著降低,TEMRA比例显著升高;心脏CD8+T细胞的Tnaive和TCM比例显著降低,TEM和TEMRA比例显著升高;心脏CD4+T细胞的Th1比例显著升高,Th17和Treg比例显著降低,心脏CD8+T细胞的IFN-γ+/GZMB+/PRF1+细胞比例显著升高。5)实时定量PCR检测发现病变心脏样本中IFN-γ,GZMB,PRF1和HLA-DR的表达显著高于正常心脏。结论1)在IHF患者心脏中,心肌局部T细胞在心肌纤维化病变区域存在病理性浸润;2)IHF患者心脏的局部T细胞的增殖活化或受到心肌组织常驻抗原提呈细胞的调控,可能具有自我增殖能力;3)IHF患者心脏T细胞可能主要为TEM和TEMRA,CD4+T细胞以Th1 T细胞为主,CD8+T细胞分泌大量的细胞毒因子,包括IFN-γ,GZMB和PRF1,可能在衰竭心肌中发挥促炎和细胞毒作用。目的T细胞表面受体（T cell receptor,TCR）β链互补决定区（complementarity determining region,CDR3）序列的高通量测序有助于全面了解T细胞免疫组库特征。本部分研究旨在通过TCRβ链CDR3区域的高通量测序来研究缺血性心衰（Ischemic heart failure,IHF）患者心脏T细胞的克隆增殖性和抗原特异性。方法1)收集14例IHF患者的心肌组织样本和外周血样本（包括第一部分的5例IHF患者）,6例正常心肌样本（包括第一部分的5例正常心脏样本）。同时采集与患者年龄、性别相配对的14名非IHF对照的外周静脉血5ml。2)提取血或心肌样本中的DNA,多重聚合酶链式反应（PCR）特异性扩增TCRβ链CDR3区域,纯化PCR产物片段并建库。利用Illumina Hiseq2000测序平台对目的捕获区域的DNA片段进行高通量测序,根据IMGT免疫基因数据库进行序列匹配;3)根据测到的所有CDR3序列（即T细胞克隆型）及其分布频率,计算出每份样本的高频克隆（HECs）比例,总克隆型数量与独特克隆型数量的比值,Shanno H指数和inverse Simpson’s多样性指数,反映每个样本T细胞的克隆增殖性。主成分分析区分IHF患者心脏T细胞相对于其他3组样本在克隆增殖性上的差异;4)比较四组样本TRBV-J重排谱的差异。主成分分析IHF患者心脏T细胞与其他3组在TRBV-TRBJ重排谱上的差异。结果1)IHF患者和非IHF对照的心脏T细胞的HECs比例分别显著高于IHF患者和对照的外周血T细胞;IHF患者心脏T细胞的总克隆数量与独特克隆型数量比值,显著高于IHF患者外周血T细胞,对照的心脏T细胞和对照的外周血T细胞;IHF患者和对照的心脏T细胞Shanno H指数和inverse Simpon’s多样性指数均分别显著低于IHF患者和对照的外周血T细胞;根据主成分分析,IHF心脏T细胞样本在克隆增殖性特征的载荷图上的几何位置与其他三组样本差异较大,呈现出与其它三组样本不同的T细胞克隆增殖性;2)IHF患者心脏T细胞与对照心脏T细胞TRBV-TRBJ重排谱的相似程度大于其与IHF患者外周血T细胞的相似程度;根据主成分分析,IHF患者和对照的心脏T细胞组,在载荷图上的几何位置相近,与来源于IHF患者和对照的外周血T细胞的几何位置不同。结论与非IHF对照心脏T细胞相比,IHF患者心脏T细胞可能具有更加显著的克隆增殖性,但其与非IHF对照的心脏T细胞有着相似的TRBV-TRBJ重排谱,理论上提示IHF患者心脏和非IHF对照的心脏T细胞可能存在相似的抗原特异性。与IHF患者外周血T细胞相比,IHF患者心脏T细胞不仅可能呈现出更显著的克隆增殖性和减少的TCR多样性,还或表现为完全不同的TRBV-TRBJ重排谱。目的本部分研究旨在研究不同IHF患者T细胞表面受体（T cell receptor,TCR）的克隆共享性及其与个体人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）基因背景的关系。方法1)收集14例IHF患者的心肌组织样本和外周血样本（包括第一部分的5例IHF患者）,6例正常心肌样本（包括第一部分的5例正常心脏样本）。同时采集与患者年龄、性别相配对的14名对照的外周静脉血5ml。2)提取血或心肌样本中的DNA,多重聚合酶链式反应（PCR）特异性扩增所有48份DNA样本中的TCRβ链CDR3区域,纯化PCR产物片段并建库。利用Illumina Hiseq2000测序平台对目的捕获区域的DNA片段进行高通量测序,根据IMGT数据库进行序列匹配;3)根据每份样本按照频数大小排列的前1000个TCR克隆型,计算两两样本之间的克隆共享率,包括4组样本组内和组间的两两样本之间克隆共享率。4)将IHF心脏T细胞组内的共享克隆定义为IHF疾病相关性T细胞克隆型,计算IHF疾病相关性克隆型在IHF患者和对照外周血T细胞全部克隆型中的占比;5)构建非IHF对照（n=60例）,稳定性IHF患者（n=52例）和重度IHF患者（n=40例）3组回顾性队列。通过基因测序明确所有对象HLA-A,B,DQB1和DRB1等4个HLA位点的基因型分型;6)卡方检验分析三组队列中HLA等位基因携带频率的差异,分析携带特定的HLA等位基因与重度IHF的关系,并计算比值比和95%置信区间。结果1)IHF患者心脏T细胞样本组内的TCR克隆共享率高于IHF患者外周血T细胞样本组内的共享率;2)IHF患者与非IHF对照的心脏T细胞样本,和IHF患者心脏与配对的外周血T细胞样本的组间TCR克隆共享率均显著高于IHF患者心脏与对照外周血T细胞组的组间共享率;IHF患者心脏与非配对的外周血T细胞样本稍高于IHF患者心脏与对照外周血T细胞组的组间共享率;3)共享T细胞克隆型在全部克隆型的比例在IHF患者心脏T细胞样本中最高,这些共享克隆被定义为IHF疾病相关性克隆,IHF疾病相关性T细胞克隆在IHF患者外周血T细胞全部克隆中的占比显著高于非IHF对照;4)心脏T细胞中有相同的高频TCR克隆型的IHF患者,在1个或多个HLA位点的等位基因相同;5)HLA-A*11:01和HLA-B*46:01的基因频率在非IHF对照和稳定性IHF患者中无显著差异。然而重度IHF患者HLA-A*11:01和HLA-B*46:01的基因频率显著高于非IHF对照。重度IHF患者HLA-B*46:01的基因频率也显著高于稳定性IHF患者,重度IHF患者的HLA-A*11:01的基因频率相对于稳定性IHF患者有更高的趋势。结论心脏T细胞样本之间的克隆共享率可能显著高于外周血T细胞样本,尤其是IHF患者的心脏T细胞。心脏T细胞都表达相似且具有组织特异性的TRBV基因和TRBV-J重排组合,在理论上提示非IHF对照和IHF患者的心脏T细胞可能识别了相同的心脏特异性抗原。HLA可能与IHF患者的TCR克隆频谱改变相关。HLA等位基因包括HLA-A*11:01 and B*46:01或可用于预测心肌梗死后IHF的发生发展。