研究背景和目的骨肉瘤是由能产生骨样组织的间充质细胞所构成的恶性骨肿瘤,其好发于青少年,男女发病率之比为1.5：1-2：1,多发生于长管状骨得干骺端,其中最常见于膝关节周边的股骨远端和胫骨上端。80%-90%的病人就诊时已存在亚临床转移灶,故骨肉瘤是一种具有微小转移灶的全身性疾病。目前治疗是主要以手术治疗为主的综合治疗。化疗明显改善骨肉瘤之前较差的预后,5年无病生存率为15%至20%。化疗使得术后生存率升高至75%至80%,局部复发率为5%至7%,术后生存率和局部复发率与手术切缘和对化疗的敏感性有关。骨肉瘤的治疗研究主要集中在筛选敏感治疗方案及治疗药物,对化疗药组织反应欠佳或耐药患者(通常肿瘤复发或转移的可能性更大),则考虑其他治疗方案或药物。骨肉瘤的另一个研究热点则是寻找治疗的新靶点,以提高肿瘤对化疗药物的组织反应性,增强化疗作用,降低化疗药物毒性,减轻化疗副反应,对常规抗肿瘤药物组织反应欠佳的肿瘤尤其重要。三是寻找新的抗肿瘤药物,或老药新用进行抗肿瘤治疗,此亦属于新药开发范畴。小檗碱又称黄连素。一种常见的异喹啉生物碱,分子式C20H18NO4.CL。它存在于小檗科等四个科十个属的许多植物中。许多研究证据表明小檗碱的盐酸盐(俗称盐酸黄连素)除了对痢疾杆菌、大肠杆菌、肺炎双球菌、金葡菌、链球菌、伤寒杆菌及阿米巴原虫有抑制作用外,已广泛用于治疗肠道感染及菌痢。近几年研究发现,小檗碱具有细胞毒性,可以通过抑制癌细胞的蛋白合成、阻滞细胞周期、促进细胞凋亡从而对多种肿瘤细胞产生抑制作用,如肝癌细胞、白血病细胞等恶性肿瘤细胞；同时,盐酸小檗碱与盐酸阿糖胞苷等多种抗肿瘤药在体外具有协同作用。亦有研究报道,盐酸小檗碱可以诱导U20S细胞发生依赖于p53基因的G1期停滞和依赖p53基因的凋亡。故本实验,在体外研究盐酸小檗碱对骨肉瘤细胞系MG-63、U20S的细胞增殖、凋亡、侵袭、转移的影响及可能的分子机制；并进一步在裸鼠移植瘤模型中,研究盐酸小檗碱对骨肉瘤的治疗作用及可能的分子机制,旨在从整体动物水平和细胞水平进一步研究盐酸小檗碱对MG-63、U2os的细胞增殖、凋亡及侵袭、转移的影响。一、体外实验盐酸小檗碱抑制骨肉瘤细胞增殖与促进凋亡的作用及其机制实验目的：探讨盐酸小檗碱对骨肉瘤细胞(MG-63及U20S)增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制。实验方法：1.MG-63及U20S细胞分别培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基及McCoy’s 5a Medium Modified培养基中,将MG-63及U20S细胞放于37℃,5%CO2的培养箱中培养。当细胞生长至90%融合时进行传代,根据实验需要给予相应的干预；2.上述传代培养的细胞,应用CCK-8法检测BBR对MG-63、U2OS细胞增殖的影响；3.上述传代培养的细胞,应用流式细胞仪检测BBR对MG-63、U2OS细胞凋亡的影响；4.上述传代培养的细胞,将p38MAPK及JNK的抑制剂SB203580及SP600125与MG-63、U2OS细胞及BBR共同孵育24 h后,应用流式细胞仪检测BBR对MG-63、U2OS细胞凋亡的影响；5.上述传代培养的细胞,随机分为Control组,DMSO组,10ug/mlBBR组,50 ug/mlBBR组,100 ug/mlBBR组,每组设5复孔。分别将溶媒DMSO, 10ug/ml BBR,50 ug/mlBBR,100 ug/mlBBR加入相应的孔中,孵育24 h后按照caspase-3活性试剂盒说明书方法检测MG-63、U2OS细胞的caspase-3活性；6.BBR干预MG-63、U20S细胞24 h后,收集细胞并提取细胞蛋白质,应用Western-blotting方法检测MG-63、U2OS细胞中Bcl-2、Bax (?)勺表达。实验结果：1.BBR呈时间与剂量依赖性抑制MG-63、U2OS细胞增殖。2.BBR诱导MG-63、U2OS细胞发生凋亡,p38MAPK抑制剂SB203580与JNK抑制剂SP600125显著抑制BBR诱导的MG-63、U2OS细胞凋亡。结果显示,对照组,溶媒组,10 ug/mlBBR组,50 ug/mlBBR组,100 ug/mlBBR组MG-63细胞凋亡的比例分别为(3.570±0.661)%,(5.820±0.456)%,(7.930±0.511)%,(13.630±1.352)%和(22.187±1.962)%；对照组,溶媒组,10ug/mlBBR组,50 ug/mlBBR组,100ug/mlBBR组U20S细胞凋亡的比例分别为(4.083±1.301)%,(7.803±0.626)%,(10.630±0.534)%,(17.470±1.984)%和(27.660±2.088)%。三种BBR组细胞凋亡的比例与溶媒组的差异具有统计学意义(P<0.05)。3.浓度为100 ug/ml的BBR引起MG-63、U20S细胞内caspase-3活性由低-高-低的变化,表现为与溶媒组相比较,100 ug/ml BBR刺激8h后胞内caspase-3活性增加,12h后caspase-3活性仍增加,而24 h后caspase-3活性则降低。结果显示,MG-63细胞对照组为6.68±0.371,7.051±1.575和6.574±0.822；溶媒组为7.423±1.113,14.103±0.525和10.577±0.787；3种作用时间的100 ug/ml BBR分别为16.857±1.174,21.795±0.381和8.97±0.076；U20S细胞对照组为7.550±1.086,6.680±1.113和8.289±0.934；溶媒组为10.903±0.236,10.886±3.156和11.752±0.773；3种作用时间的100 ug/ml BBR分别为15.464±1.754,21.129±1.138和9.135±0.243。4. Western blot检测结果显示,BBR显著下调Bcl-2的表达,上调Bax的表达。二、体外实验盐酸小檗碱降低骨肉瘤细胞迁移与侵袭能力的作用及其机制实验目的：探讨盐酸小檗碱对骨肉瘤细胞(MG-63及U20S)迁移、侵袭能力的影响及其可能的分子机制。实验方法：1.MG-63及U20S细胞分别培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基及McCoy’s 5αMedium Modified培养基中,将MG-63及U20S细胞放于37℃,5％CO2的培养箱中培养。当细胞生长至90%融合时进行传代；2.上述传代培养的细胞,应用细胞划痕实验检测MG-63及U20S细胞的迁移能力；3.上述传代培养的细胞,应用Transwell侵袭实验检测MG-63及U20S细胞的侵袭能力；4.BBR干预MG-63、U20S细胞24 h后,收集细胞并提取细胞蛋白质,应用Western-blotting方法检测MG-63、U20S细胞中MMP-2、MMP-9的表达。实验结果：1.细胞划痕实验检测显示,BBR可降低MG-63、U2OS细胞的迁移能力。结果显示,MG-63及U20S细胞对照组细胞迁移率分别为(66.3±7.1)%,(72.7±7.5)%；溶媒组分别为(63.7±5.7)%,(68.3±7.6)%；10 ug/mlBBR组分别为(53.3±3.1)%,(51.3±3.2)%;50 ug/mlBBR组分别为(41.3±4.0)%,(35.0±5.0)%;100 ug/m1BBR组分别为(26.3±3.2)%,(21.7±10.4)%。三种浓度BBR组细胞迁移率的比例与溶媒组的差异具有统计学意义(P<0.05),溶媒组细胞迁移率与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。2.Transwell侵袭实验检测显示,BBR可降低MG-63、U20S细胞的侵袭能力。结果显示,MG-63及U20S细胞对照组穿过微孔膜的细胞数分别为852.7±53,974.0±60.0；溶媒组穿过微孔膜的细胞数分别为835.7±33.1,950.0±16.0；10ug/mlBBR组穿过微孔膜的细胞数分别为681±22,715.0±95.0;50 ug/mlBBR组穿过微孔膜的细胞数分别为514±31.8,627.3±23.2;100 ug/mlBBR组穿过微孔膜的细胞数分别为331±32.9,447.3±11.9。三种浓度BBR组穿过微孔膜的细胞数与溶媒组的差异具有统计学意义(P<0.05),溶媒组穿过微孔膜的细胞数与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。3.Western blot检测结果显示,BBR下调MG-63、U20S细胞中MMP-2和MMP-9的表达。三、体内实验盐酸小檗碱抑制BALB/C-nu-nu小鼠移植瘤生长与降低侵袭能力的作用及其机制实验目的：探讨盐酸小檗碱对BALB/C-nu-nu小鼠移植瘤生长及侵袭能力的影响及其可能的分子机制。实验方法：1.MG-63细胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中,恒温37℃,含5%C02的培养箱中培养,当细胞生长至90%融合时进行传代；2.4周龄健康雄性BALB/C-nu-nu小鼠30只,分别进行标记并称重,每3只动物同笼饲养,饲养于华中科技大学同济医学院实验动物中心SPF级标准动物饲养室,室温22℃-26℃,相对湿度50%-80%,每日光照12 h,标准饲料饮食,自由进食与饮水。所有的实验动物操作程序均符合NIH实验动物管理与使用指南,以及中国科学院实验动物管理规范所制定的标准。3.实验动物适应性喂养1周后,将MG-63细胞经0.25%胰蛋白酶消化后1×PBS洗涤,调整浓度为1×107/ml,重悬于生理盐水中,将1×107个MG-63细胞注射到裸鼠一侧腋下的皮下,至裸鼠皮下移植瘤生长至约1.5 cm×1.5 cm大小,于无菌手术室中取下移植瘤研磨成细胞悬液,调整浓度为1×107/ml,将1×107个移植瘤MG-63细胞注射到三组裸鼠一侧腋下的皮下,建立BALB/C-nu-nu小鼠骨肉瘤移植瘤模型；4. BALB/C-nu-nu小鼠骨肉瘤移植瘤模型随机分为3组,每组10只小鼠,分别为：阴性对照组灌胃无菌生理盐水,阳性对照组腹腔注射阿霉素(1 ug/g.d), BBR组灌胃BBR (50 ug/g.d)。皮下成瘤后,开始执行上述干预措施,并且每两天用游标卡尺测量皮下瘤的体积直至实验结束,实验结束后手术取下移植瘤,称量移植瘤裸重,部分瘤体组织放入液氮冷冻后转入-80℃低温冰箱保存备用,同时以上部分组织标本放入甲醛溶液中固定,脱水浸腊石蜡包埋后室温保存备用；5.应用裸鼠皮下成瘤实验检测BBR对MG-63细胞体内增殖的影响；6.应用免疫组织化学方法检测移植瘤中MMP-2、MMP-9及nm-23的表达。实验结果：1.按以上方法对裸鼠进行肿瘤细胞种植,于种植后第12天出现皮下移植瘤。实验结束后手术取下移植瘤,称量移植瘤裸重并记录肿瘤最后一次测量体积,结果显示阴性对照组裸鼠移植瘤在第36天体积为(5.4016±0.3774)cm3；阳性对照组裸鼠移植瘤在第36天体积为(3.8484±0.1963)cm3;BBR组裸鼠移植瘤在第36天体积为(4.2525±0.2822)cm3；阴性对照组裸鼠移植瘤裸重为(2.9471±1.3682)g；阳性对照组裸鼠移植瘤裸重为(1.285±0.1864)g；BBR组裸鼠移植瘤裸重为(1.8452±0.6963)g。与阴性对照组相比较,阳性对照组与BBR组裸鼠体积及裸重有显著差异(P<0.05)；与阳性对照组相比较,BBR组裸鼠体积及裸重无显著差异(P>0.05)。2.实验结束时,每个肿瘤切取部分组织用4%多聚甲醛固定,后经免疫组织化学法检测BBR对肿瘤组织内相关蛋白质的表达影响。结果显示,阳性对照组、BBR组与阴性对照组相比较,MMP-2与MMP-9的表达水平有统计学差异(P<0.05),与阳性对照剂阿霉素相比较,盐酸小檗碱对MMP-2的表达无统计学差异(P>0.05),而对MMP-9的表达有统计学差异(P<0.05)；阳性对照组、BBR组与阴性对照组相比较,nm-23的表达水平有统计学差异(P<0.05),与阳性对照剂阿霉素相比较,盐酸小檗碱对nm-23的表达水平变化无统计学差异(P>0.05)。统计学分析所有数据均以均数±标准差表示,应用SPSS13.0软件进行统计学分析,各分组组间差异采用单因素方差分析(ANOVA),以P<0.05为差异具有统计学意义。结论1.BBR呈时间与剂量依赖性抑制MG-63、U20S细胞增殖。2.BBR可能通过激活p38MAPK与JNK信号转导通路进而启动了MG-63、U20S细胞凋亡。3.BBR降低MG-63、U20S细胞侵袭能力,其可能的分子机制是BBR下调MMP-2和MMP-9的表达。4.成功建立了BALB/C-nu-nu小鼠骨肉瘤移植瘤模型。5.BBR可在一定程度上降低BALB/C-nu-nu小鼠骨肉瘤移植瘤的生长增殖能力。6.BBR可改善BALB/C-nu-nu小鼠骨肉瘤移植瘤模型的恶液质状态。7.BBR可降低BALB/C-nu-nu小鼠骨肉瘤移植瘤的侵袭转移能力,其可能的分子机制是BBR下调MMP-2和MMP-9的表达,上调nm-23的表达。