食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，我国河南和山西是食管癌发病率和死亡率最高的地区，且呈不断上升趋势。食管癌起病隐匿，早期缺乏明显的临床症状，且早期筛查和教育指导没有得到根本的改善，故而患者出现症状时多为中晚期，预后差，患者5年生存率仅10%左右。目前食管癌的治疗方式以手术、化疗、放疗为主，但单一的治疗方式难以达到良好的效果，复发率高，而手术、放化疗结合的综合治疗又因副作用大、效果不明显，在临床应用中未能得到普及。因此，寻求一种能够早期诊断和靶向性高的治疗方式成为一个新的方向。近几年来，肿瘤的生物治疗被广泛的研究和应用于临床，单克隆抗体制备的成功，成为生物治疗的一个重要研究方向。将单克隆抗体偶联的靶向药物准确地结合到肿瘤靶细胞的特异性分子上，从而发挥靶向治疗作用。因此，找到一种可以与食管癌细胞表面分子特异性结合的高亲和力配体作为载体，可有效筛查出早期食管癌患者，降低靶向治疗药物的毒副作用，提高肿瘤细胞局部的药物浓度，增强其在食管癌早期诊断和靶向治疗效果的临床价值。1985年Smith提出噬菌体展示肽库技术的概念并在1990年由Huse成功的构建了第一个噬菌体组合文库，为肿瘤的早期诊断和靶向治疗提供了一个新的方法。利用噬菌体单链抗体分子量小、组织穿透性强、能够迅速到达靶抗原部位的特点，我们尝试构建人源性食管癌抗体文库，并对食管癌细胞株Eca109进行筛选。本实验旨在应用噬菌体随机肽库筛选出与食管癌细胞Eca109特异性结合的多肽，为食管癌的早期诊断、靶向治疗提供理论依据。本实验以人源食管癌细胞株Eca109为靶细胞，人正常食管上皮细胞为吸附细胞，对噬菌体随机十二肽库进行3轮减性筛选。体外筛选3轮后，随机挑取20个噬菌体克隆，采用细胞ELISA检测、免疫荧光染色方法鉴定阳性噬菌体克隆与食管癌细胞Eca109结合的特异性，排除假阳性或非特异性结合的噬菌体。再利用筛选得到的噬菌体阳性克隆对食管癌组织进行特异性结合实验，采用DAB染色技术证明其不与正常食管组织特异性结合。挑取能与食管癌细胞Eca109特异性结合的噬菌体阳性克隆的DNA并进行测序，进行氨基酸序列的同源性分析。本实验结果显示：经过3轮减性筛选，逐轮提高噬菌体阳性克隆的筛选标准，保持噬菌体投入量，回收量由2.1×10-8增至3.4×10-5，提高约103倍，说明噬菌体在食管癌靶细胞Eca109上出现了明显富集。从蓝斑中随机挑取20个噬菌体阳性克隆，经细胞ELISA检测证实，有9个噬菌体阳性克隆能与食管癌细胞Eca109特异性结合，其中有2个噬菌体阳性克隆只与食管癌靶细胞Eca109特异性结合，而不与正常食管上皮细胞结合。将这2个噬菌体阳性克隆分别与食管癌细胞Eca109进行细胞免疫荧光检测，进一步证实其能与食管癌靶细胞特异性结合，而不与正常食管上皮细胞结合。从这2个噬菌体阳性克隆分别与食管癌组织、正常食管组织结合后的DAB染色中，我们得到这2个噬菌体阳性克隆不与正常食管组织特异性结合。提取上述2个噬菌体阳性克隆的DNA，测序后分析结果显示：2个肽序列中非极性脂肪性氨基酸占41.67%，极性中性氨基酸占33.33%，氨基酸序列未见同源性。经BLAST分析可知，在已有的蛋白质数据库中未发现与这些短肽序列完全一致或有同源性的蛋白质分子。本实验利用噬菌体展示肽库技术，成功筛选出与食管癌细胞特异性结合的噬菌体。通过细胞ELISA和细胞免疫荧光检测鉴定出2个噬菌体阳性克隆对食管癌细胞Eca109有高度特异性和亲和力。DBA染色实验证实其不与正常食管组织特异性结合，经过提取2个噬菌体阳性克隆的DNA，测序后得到2个氨基酸序列，无同源性，BLAST分析该氨基酸序列与已有蛋白质数据库中的蛋白质分子未见一致性或同源性。本实验得到的2个噬菌体阳性克隆有可能成为抑制食管癌的靶向治疗的载体，需进一步合成噬菌体阳性克隆氨基酸序列编码的短肽，并应用到活体实验中，以证实其对食管癌细胞的特异性亲和力，为研制食管癌特异性靶向诊治的药物奠定实验基础。