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沙门氏菌属于肠杆菌科细菌,由此类细菌引起的各种动物疾病称为沙门氏菌病。目前,沙门氏菌污染禽蛋肉产品已成为严重的全球性食品安全问题,其主要病原为肠炎沙门氏菌。SEF14菌毛特异性表达于肠炎沙门氏菌和都柏林沙门氏菌等D-群沙门氏菌中,而都柏林沙门氏菌属于偏嗜性沙门氏菌,临床感染较少。因此,本试验以SEF14菌毛为研究对象,通过优化SEF14菌毛表达条件和制备抗SEF14菌毛的单克隆抗体,以期建立肠炎沙门氏菌特异性诊断方法,为临床诊断奠定基础。研究一：设计4种不同的方法表达SEF14菌毛,通过匀浆抽提菌毛进行SDS-PAGE检测和透射电镜观察菌毛的表达,以期筛选出肠炎沙门氏菌SEF14菌毛最优表达条件。结果显示方法4的表达条件最优,电镜下可观察到SEF14菌毛,且同等条件下的菌毛抽提量最多,即接种肠炎沙门氏菌标准株50336于TSB培养基中,25℃摇床培养24h,次日按1：100转接到新的TSB培养基中,20℃摇床培养24h,第三天按1：50转接到CFA(pH6.0)培养基中,37℃静置培养50-60h。按上述方法培养标准株50336,用抗SEF14菌毛单克隆抗体和胶体金标记的羊抗小鼠IgG分别孵育进行免疫电镜,结果显示在菌毛表面吸附有胶体金颗粒,进一步表明成功表达出SEF14菌毛。此外,在SEF14菌毛最优表达条件下,采用匀浆抽提法提取SEF14菌毛蛋白,SDS-PAGE结果显示从肠炎沙门氏菌标准株50336中成功抽提出大小为14.3KD的蛋白,与相关报道一致,Western-blotting结果进一步表明上述蛋白抽提物能被抗SEF14单克隆抗体识别,为SEF14菌毛。研究二：将表达SEF14菌毛的肠炎沙门氏菌标准株50336用甲醛灭活,免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,用匀浆抽提的SEF14菌毛蛋白作为检测原进行间接ELISA筛选,得到3株分泌性能稳定的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为3E4、3E7和3H5,腹水抗体效价分别为1:128000.1:64000.1:64000. Western-blotting特异性检测结果显示3株单克隆抗体均能与匀浆抽提的SEF14菌毛蛋白、肠炎沙门氏菌标准株50336和都柏林沙门氏菌C79-84发生免疫反应,在14.3KD处出现特异性的条带,而与其他4株沙门氏菌和3株大肠杆菌均不发生反应,说明本试验得到的单克隆抗体具有良好的特异性。研究三：本试验利用制备的抗SEF14菌毛单克隆抗体建立了一种肠炎沙门氏菌特异性诊断方法,即SEF14蛋白介导的双抗体夹心间接ELISA方法(SEF14-DAS ELISA)。该方法是将单克隆抗体作为捕获抗体包被酶标板,抗SEF14菌毛的鸡血清样本为第二抗体；方阵滴定试验确定捕获抗体和SEF14蛋白的最佳工作浓度分别为8μg/mL和2μg/mL。用建立的SEF14-DAS ELISA检测100份鸡血清样本,59份为阳性,与肠炎沙门氏菌特异性基因片段sdfI的PCR符合率达93%。本试验建立的方法特异性强,灵敏性高,可用于临床诊断,对肠炎沙门氏菌特异性检测有潜在的应用前景。